Иммунофлуоресценция и локализация белков

Иммунофлуоресценция использует антитела, связанные с флуоресцентными красителями, для обнаружения специфических молекул в клетках и тканях, благодаря чему целевой белок или антиген светится там, где он расположен. Она объединяет специфичность связывания антител с контрастностью флуоресцентной микроскопии и является основным методом картирования расположения белков в клетке.

Definition

Иммунофлуоресценция (метод флуоресцирующих антител) — это метод, при котором антитела, конъюгированные с флуорофорами, связываются с целевым антигеном, так что его расположение в клетке или ткани может быть визуализировано с помощью флуоресцентной микроскопии; локализация белка — это определение того, где данный белок находится в клетке.

Scope

Статья охватывает принцип флуоресцентного мечения на основе антител, схемы прямого и непрямого обнаружения, а также использование метода для локализации белков в клеточных компартментах. Она рассматривает иммунофлуоресценцию как метод локализации в рамках клеточной визуализации, а не как клиническую инструкцию.

Core questions

• Как антитело придает молекулярную специфичность флуоресцентному сигналу?
• Что отличает прямую иммунофлуоресценцию от непрямой?
• Как белок приписывается к определенному клеточному компартменту?
• Какие контроли защищают от неспецифических или ложных сигналов?

Key concepts

• Специфичность антиген-антитело
• Конъюгация флуорофоров
• Прямое и непрямое обнаружение
• Колокализация
• Присвоение субклеточного компартмента
• Контроли специфичности

Mechanisms

Антитело, полученное против целевого антигена, связывается с флуоресцентным красителем, как впервые продемонстрировали Кунс и его коллеги, так что связывание отмечает положение антигена флуоресцентным сигналом, считываемым микроскопией; Кунс и Каплан усовершенствовали тканевой метод, чтобы антигены могли надежно обнаруживаться в клетках. При прямой иммунофлуоресценции меченое антитело связывается с самой мишенью, тогда как при непрямой иммунофлуоресценции немеченое первичное антитело обнаруживается меченым вторичным антителом, что усиливает сигнал. Локализация считывается по тому, где сигнал падает относительно известных маркеров, а расширенный набор флуоресцентных инструментов, рассмотренный Гипмансом и его коллегами, — включая флуоресцентные белки — распространяет такую локализацию на живые клетки, в то время как методы сверхвысокого разрешения, исследованные Шермелле и его коллегами, обостряют ее ниже дифракционного предела. Контроли специфичности необходимы для отличия истинного связывания от фонового.

Clinical relevance

Иммунофлуоресценция используется в диагностике — например, при биопсии почек и кожи, а также для обнаружения аутоантител — и широко в исследованиях для локализации белков. Эта статья объясняет, как генерируется и интерпретируется сигнал локализации, и носит справочно-образовательный характер, а не является основой для индивидуальных диагностических или лечебных решений.

History

Альберт Кунс и его коллеги представили мечение флуоресцентными антителами около 1941 года и усовершенствовали его для обнаружения тканевых антигенов к 1950 году, заложив основы иммунофлуоресценции. Последующее появление ярких флуорофоров и генетически кодируемых флуоресцентных белков, каталогизированных в наборе флуоресцентных инструментов Гипманса и его коллег, а также сверхразрешающей визуализации значительно расширило точность, с которой белки могут быть локализованы в клетках.

Key figures

• Albert Coons
• Roger Tsien
• Mark Ellisman

Seminal works

• coons-1941
• coons-1950
• giepmans-2006

Frequently asked questions

В чем разница между прямой и непрямой иммунофлуоресценцией?

При прямой иммунофлуоресценции флуорофор присоединен к антителу, которое связывается с мишенью; при непрямой иммунофлуоресценции меченое вторичное антитело обнаруживает немеченое первичное антитело, что усиливает сигнал.

Как иммунофлуоресценция показывает, где находится белок в клетке?

Антитело связывается только со своим специфическим антигеном, поэтому флуоресцентный сигнал появляется везде, где расположен этот белок, а его положение относительно известных клеточных маркеров показывает компартмент, который он занимает.