Световая микроскопия и увеличение

Световая микроскопия использует видимый свет и систему линз для получения увеличенного изображения образца и является старейшим и наиболее широко используемым средством исследования клеток и тканей. Увеличение делает изображение крупнее, но полезная детализация определяется разрешением, которое волновой природой света ограничивается примерно масштабом используемой длины волны света.

Definition

Световая микроскопия — это микроскопия, при которой видимый свет, проходящий через образец или отраженный от него, фокусируется линзами для формирования увеличенного изображения; увеличение — это коэффициент, на который изображение увеличивается, в то время как разрешение — это наименьшее расстояние, при котором две точки остаются различимыми.

Scope

Статья охватывает принципы формирования увеличенного изображения составным микроскопом, различие между увеличением и разрешением, дифракционный предел, ограничивающий разрешающую способность, а также распространенные режимы контрастирования для просмотра в значительной степени прозрачных клеток. Она рассматривает световую микроскопию как фундаментальный метод визуализации, а не как клиническое руководство.

Core questions

• В чем разница между увеличением и разрешением?
• Почему длина волны света устанавливает предел разрешающей способности?
• Как получить контраст от почти прозрачных живых клеток?
• Когда увеличение перестает добавлять полезные детали?

Key concepts

• Увеличение
• Разрешение и дифракционный предел
• Числовая апертура
• Светлое поле, фазовый контраст и дифференциально-интерференционный контраст
• Пустое увеличение
• Окрашивание для контраста

Mechanisms

Составной микроскоп использует объектив и окуляр для увеличения изображения образца, но детализация, которая может быть разрешена, зависит от дифракции: как формализовано в теории формирования изображения Аббе XIX века, разрешающая способность улучшается с уменьшением длины волны и увеличением числовой апертуры, поэтому микроскопы видимого света не могут разрешать объекты значительно меньше нескольких сотен нанометров. Увеличение сверх того, что поддерживает разрешение, приводит к пустому увеличению — более крупному, но не более детализированному изображению. Поскольку клетки в значительной степени прозрачны, контраст создается окрашиванием или оптическими методами, такими как фазовый контраст и дифференциально-интерференционный контраст, которые преобразуют различия в показателе преломления в видимые различия интенсивности.

Clinical relevance

Световая микроскопия занимает центральное место в гистологии, цитологии, гематологии и микробиологии, где окрашенные образцы исследуются на предмет диагностических признаков. Эта статья объясняет оптические принципы, лежащие в основе таких изображений, и носит справочно-образовательный характер, а не является основой для индивидуальных диагностических или лечебных решений.

History

Составные световые микроскопы позволяли обнаруживать клетки с XVII века, но количественное понимание их ограничений пришло с дифракционной теорией Аббе 1873 года, которая связала разрешающую способность с длиной волны и числовой апертурой и объяснила, почему оптическая микроскопия не может разрешать произвольно малые детали. Этот дифракционный барьер определял микроскопию более века и стимулировал развитие как электронной микроскопии, так и, позднее, флуоресцентных методов сверхвысокого разрешения.

Key figures

• Ernst Abbe
• Douglas Murphy

Seminal works

• abbe-1873
• murphy-2012

Frequently asked questions

Всегда ли более высокое увеличение лучше?

Нет. Увеличение только увеличивает изображение; за пределом, установленным разрешением, оно производит пустое увеличение — более крупное, но не более детализированное изображение.

Почему световой микроскоп не может разрешать очень мелкие структуры?

Из-за дифракции разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной волны видимого света и числовой апертурой объектива, что ограничивает детализацию примерно несколькими сотнями нанометров.