Фиксация и заливка тканей

Фиксация и заливка являются первыми этапами подготовки тканей в гистологии. Фиксация химически стабилизирует ткань, останавливая ее разложение и сохраняя структуру, в то время как заливка окружает фиксированную ткань твердой поддерживающей средой, что позволяет нарезать ее на тонкие срезы. Вместе они определяют, насколько точно конечный препарат отражает живую ткань.

Definition

Фиксация тканей — это химическая или физическая обработка, которая останавливает аутолиз и гниение и стабилизирует структуру ткани; заливка — это последующая инфильтрация фиксированной, обработанной ткани поддерживающей средой (такой как парафин или смола), чтобы можно было получить тонкие срезы.

Scope

Эта тема охватывает цели и основные химические принципы фиксации, этапы обработки тканей (обезвоживание, просветление, инфильтрация) и заливку в парафин или смолу. Это методологический справочник, который не содержит клинических или лабораторных протоколов дозирования.

Core questions

• Как фиксатор останавливает деградацию тканей, сохраняя при этом их структуру?
• Чем отличаются сшивающие и коагулирующие фиксаторы по своему действию?
• Почему ткань должна быть обезвожена, просветлена и инфильтрирована перед заливкой?
• Как заливочная среда ограничивает толщину среза и последующий анализ?

Key concepts

• Аутолиз и его остановка
• Сшивающие (альдегидные) фиксаторы
• Коагулирующие (спиртовые) фиксаторы
• Формалиновая фиксация
• Обезвоживание и просветление
• Парафиновая заливка
• Заливка в смолу

Mechanisms

Фиксаторы действуют по одному из двух широких механизмов. Сшивающие фиксаторы, такие как формальдегид и глутаральдегид, образуют метиленовые или более длинные мостики между реактивными группами (главным образом на белках), фиксируя молекулярную структуру; глутаральдегид, имеющий две альдегидные группы, образует более обширные сшивки и особенно хорошо сохраняет тонкую ультраструктуру, поэтому он стал центральным в фиксации для электронной микроскопии (Sabatini, 1963). Коагулирующие фиксаторы, такие как этанол, действуют путем обезвоживания и осаждения белков. Поскольку сшивание может маскировать антигены, были разработаны фиксаторы, которые балансируют сохранение структуры с сохранением реактивности, как, например, в составе периодатно-лизин-параформальдегида, разработанном для иммуноэлектронной микроскопии (McLean & Nakane, 1974). После фиксации ткань обезвоживается в спиртах возрастающей концентрации, просветляется в растворителе, смешивающемся с заливочной средой, и инфильтрируется расплавленным парафином или жидкой смолой, которые после затвердевания обеспечивают механическую поддержку, необходимую для микротомии.

Clinical relevance

Фиксация и заливка определяют качество и молекулярную сохранность тканевых блоков, используемых в диагностической патологии и исследованиях. Эта статья концептуально объясняет методы; она описывает, как готовятся препараты, и не является основой для принятия индивидуальных диагностических или лечебных решений.

Evidence & guidelines

Практика фиксации и обработки консолидирована в стандартных гистотехнологических справочниках, таких как «Теория и практика гистологических методов Бэнкрофта» (Suvarna et al., 2018) и Кирнана (Kiernan, 2015). Преаналитические переменные фиксации (тип фиксатора, время до фиксации, продолжительность) признаны влияющими на последующие молекулярные анализы и рассматриваются в литературе по качеству лабораторных исследований в рамках соответствующих тем иммуногистохимии и оценки качества.

History

Практическая химия фиксации развивалась на протяжении девятнадцатого века, при этом формалин был введен в качестве фиксатора тканей в конце 1890-х годов, а парафиновая заливка стала основным способом получения тонких срезов. В двадцатом веке фиксация глутаральдегидом была охарактеризована для сохранения ультраструктуры (Sabatini, 1963), и были разработаны специализированные фиксаторы для сохранения антигенности наряду со структурой (McLean & Nakane, 1974).

Key figures

• David Sabatini
• Paul Nakane

Seminal works

• sabatini-1963
• mclean-1974

Frequently asked questions

Почему формалин является наиболее распространенным фиксатором для рутинной гистологии?

Буферный формальдегид достаточно хорошо проникает в ткани, сшивает белки для широкого сохранения структуры, недорог и совместим с рутинным окрашиванием и большинством последующих анализов, что сделало его стандартным фиксатором общего назначения.

Почему ткань должна быть обезвожена и просветлена перед парафиновой заливкой?

Парафин не смешивается с водой, поэтому вода из ткани замещается спиртами возрастающей концентрации (обезвоживание), а затем растворителем, смешивающимся с парафином (просветление), прежде чем расплавленный парафин сможет инфильтрировать и поддерживать ткань.