Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция

Иммуногистохимия (ИГХ) и иммунофлуоресценция используют антитела для локализации специфических молекул в срезе ткани. Антитело связывается со своей целевой антигеном in situ, а затем становится видимым — с помощью фермента, который осаждает окрашенный продукт (ИГХ), или с помощью флуоресцентной метки, наблюдаемой под флуоресцентным микроскопом (иммунофлуоресценция), — что позволяет идентифицировать типы клеток и молекулы, которые рутинные окрашивания не могут различить.

Definition

Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция — это методы, основанные на антителах, которые локализуют специфические антигены в срезах тканей путем связывания меченых антител с их мишенями и обнаружения связанной метки посредством ферментативных цветных реакций (иммуногистохимия) или флуоресценции (иммунофлуоресценция).

Scope

Эта тема охватывает принцип мечения на основе антител, прямое и непрямое обнаружение, системы усиления сигнала, демаскировку антигенов, а также валидацию и контроль качества этих анализов. Это методологический справочник, который не предоставляет клинической интерпретации или рекомендаций по лечению.

Core questions

• Как антитело обеспечивает молекулярно-специфическую локализацию в ткани?
• В чем заключаются различия между прямым и непрямым методами обнаружения?
• Как системы усиления сигнала и демаскировка антигенов повышают чувствительность?
• Как валидируются и контролируются анализы на основе антител для надежной интерпретации?

Key concepts

• Специфичность связывания антиген-антитело
• Прямое против непрямого обнаружения
• Усиление сигнала (например, авидин-биотин, полимерные системы)
• Хромогенные против флуоресцентных меток
• Демаскировка антигена (эпитопа)
• Контроли и валидация анализа
• Специфичность и перекрестная реактивность

Mechanisms

Ключевым событием является специфическое связывание антитела с его антигеном в пределах среза. При прямом методе первичное антитело само несет метку; при непрямом методе немеченое первичное антитело обнаруживается меченым вторичным антителом, что одновременно усиливает и стандартизирует обнаружение. Кунс и его коллеги впервые показали, что антитело, меченое флуоресцентной группой, может локализовать свой антиген в ткани (Coons, 1941), положив начало иммунофлуоресценции. Затем ферментативное обнаружение позволило получать постоянные хромогенные сигналы, а чувствительность была повышена за счет систем усиления, таких как авидин-биотиновый пероксидазный комплекс (Hsu et al., 1981) и, позднее, полимерное обнаружение. Поскольку альдегидная фиксация может маскировать эпитопы посредством сшивания, часто используются этапы демаскировки антигенов с помощью нагревания или протеаз для восстановления связывания антител в фиксированных формалином парафиновых срезах тканей (Shi et al., 1991). Надежная интерпретация зависит от соответствующих положительных и отрицательных контролей и от формальной аналитической валидации каждого анализа (Fitzgibbons et al., 2014).

Clinical relevance

Мечение на основе антител лежит в основе большей части современной тканевой диагностики и исследований, идентифицируя клеточную линию и специфические молекулярные маркеры. Эта статья концептуально описывает методы и их требования к качеству; она является справочным ориентиром, а не основой для индивидуальных диагностических или лечебных решений.

Evidence & guidelines

Профессиональные рекомендации по аналитической валидации иммуногистохимических анализов были выпущены Колледжем американских патологов (Fitzgibbons et al., 2014), а принципы методов консолидированы в стандартных гистотехнологических справочниках (Suvarna et al., 2018). Методы демаскировки антигенов и усиления сигнала основаны на фундаментальных первичных исследованиях (Shi et al., 1991; Hsu et al., 1981).

History

Локализация на основе антител началась с метода флуоресцентных антител Кунса и его коллег в 1941 году, который сделал возможным молекулярно-специфическое обнаружение в тканях. Методы ферментного мечения позднее дали постоянные видимые сигналы, системы усиления, такие как авидин-биотиновый пероксидазный комплекс (Hsu et al., 1981), повысили чувствительность, а тепловая демаскировка антигенов (Shi et al., 1991) расширила надежное иммуноокрашивание на рутинно фиксированный, парафинированный материал. Стандартизация и рекомендации по валидации появились по мере того, как методы стали центральными в диагностической практике (Fitzgibbons et al., 2014).

Key figures

• Albert Coons
• Su-Ming Hsu
• Shan-Rong Shi

Seminal works

• coons-1941
• hsu-1981
• shi-1991

Frequently asked questions

В чем разница между иммуногистохимией и иммунофлуоресценцией?

Оба метода используют антитела для локализации антигенов в ткани; иммуногистохимия визуализирует связанное антитело с помощью фермента, который осаждает окрашенный продукт, видимый под световым микроскопом, в то время как иммунофлуоресценция использует флуоресцентную метку, наблюдаемую под флуоресцентным микроскопом.

Почему часто необходима демаскировка антигенов?

Формалиновая фиксация сшивает белки и может маскировать эпитопы, которые распознают антитела; этапы демаскировки антигенов с помощью нагревания или ферментов могут демаскировать эти эпитопы, чтобы окрашивание стало возможным в фиксированных формалином, парафинированных тканях.