Sequenciamento de DNA

Como a ordem das bases no DNA é determinada — do método de terminação de cadeia de Sanger às tecnologias massivamente paralelas que leem genomas inteiros.

Definition

O sequenciamento de DNA é a determinação da ordem precisa dos nucleotídeos em uma molécula de DNA, alcançada historicamente pela síntese de terminação de cadeia e agora predominantemente por métodos massivamente paralelos que leem muitos fragmentos simultaneamente.

Scope

Este tópico abrange métodos para ler a sequência de nucleotídeos do DNA: o método de terminação de cadeia (Sanger) e seu princípio de terminação base-específica, e as abordagens de alto rendimento e massivamente paralelas que o sucederam e tornaram o sequenciamento em escala genômica rotineiro. Ele trata da lógica do sequenciamento; a amplificação e clonagem que preparam o DNA para o sequenciamento são abordadas em tópicos complementares.

Core questions

• Como o sequenciamento por terminação de cadeia revela a ordem das bases?
• Por que os dideoxinucleotídeos marcados tornaram o sequenciamento prático?
• Como os métodos massivamente paralelos escalam o sequenciamento para genomas inteiros?
• Como as leituras curtas são montadas em sequências e genomas mais longos?

Key theories

Sequenciamento por terminação de cadeia

A síntese na presença de dideoxinucleotídeos que terminam a cadeia produz um conjunto de fragmentos que terminam em cada ocorrência de uma dada base, e a ordenação destes por comprimento revela a sequência, conforme introduzido por Sanger e colegas.

Sequenciamento massivamente paralelo

A leitura de um número enorme de fragmentos de DNA de uma só vez e a reconstrução computacional da sequência reduziram drasticamente o custo e aumentaram o rendimento, permitindo o sequenciamento rotineiro em escala genômica.

Mechanisms

No sequenciamento por terminação de cadeia, um primer é estendido ao longo de um molde na presença de nucleotídeos normais mais uma pequena proporção de dideoxinucleotídeos que, uma vez incorporados, interrompem a síntese; o resultado é um conjunto aninhado de fragmentos cuja base terminal é conhecida, que são separados por tamanho para ler a sequência. As plataformas modernas massivamente paralelas imobilizam e amplificam muitos fragmentos de molde e detectam a incorporação de bases em todos eles simultaneamente, gerando um grande número de leituras curtas que o software alinha ou monta na sequência completa.

Clinical relevance

O sequenciamento é a base do diagnóstico genético, da genômica do câncer, da vigilância de patógenos e das abordagens personalizadas da medicina; oferecido como significado, não como orientação clínica.

History

O método de terminação de cadeia de Sanger e o método químico paralelo de Maxam-Gilbert, ambos da década de 1970, tornaram o sequenciamento de DNA viável e renderam reconhecimento Nobel; o surgimento de tecnologias massivamente paralelas nos anos 2000 reduziu os custos em ordens de magnitude e inaugurou a era genômica.

Key figures

• Frederick Sanger
• Walter Gilbert

Seminal works

• sanger1977
• lodish2016

Frequently asked questions

O que é um dideoxinucleotídeo e por que ele é usado no sequenciamento?

É um nucleotídeo modificado que, uma vez adicionado, interrompe a síntese; sua incorporação em posições aleatórias gera fragmentos que terminam em cada base, o que revela a sequência.

Como genomas inteiros podem ser sequenciados tão rapidamente agora?

Plataformas massivamente paralelas leem milhões de fragmentos de DNA de uma só vez e usam software para montá-los, aumentando drasticamente a velocidade e diminuindo o custo em comparação com métodos anteriores.