Sequenciamento e Montagem de Genomas

Ler um genoma significa determinar a ordem de seus bilhões de bases, o que as máquinas de sequenciamento fazem apenas em pequenos pedaços, deixando para o software a tarefa de reconstruir a sequência completa, encontrando onde esses pedaços se sobrepõem.

Definition

O sequenciamento de genomas é a determinação experimental da ordem de nucleotídeos do DNA de um organismo, e a montagem é a reconstrução computacional da sequência completa a partir das muitas leituras curtas que um sequenciador produz.

Scope

Este tópico abrange o sequenciamento dideoxi de Sanger, os princípios do sequenciamento de próxima geração e de leitura longa, as estratégias de "whole-genome shotgun" e baseadas em clones, a montagem computacional de leituras em contigs e scaffolds, medidas de qualidade de montagem como cobertura e contiguidade, e os genomas de referência resultantes. Ele trata de como a sequência de um genoma é determinada; a interpretação dessa sequência é abordada nos tópicos adjacentes.

Core questions

• Como o sequenciamento de Sanger determina a ordem das bases usando terminadores de cadeia?
• O que torna o sequenciamento de próxima geração e de leitura longa mais rápidos e baratos, e quais são suas vantagens e desvantagens?
• Como milhões de leituras sobrepostas são montadas em cromossomos?
• O que as medidas de cobertura e contiguidade nos dizem sobre a qualidade de uma montagem?

Key concepts

• Sequenciamento dideoxi de Sanger
• Sequenciamento de próxima geração e de leitura longa
• Estratégia "whole-genome shotgun"
• Montagem de leituras: contigs e scaffolds
• Cobertura, contiguidade e genomas de referência

Mechanisms

O sequenciamento de Sanger utiliza dideoxinucleotídeos terminadores de cadeia para gerar uma escada de fragmentos cujos comprimentos revelam a sequência; plataformas massivamente paralelas leem milhões de fragmentos de uma vez, e o software de montagem detecta sobreposições entre as leituras para fundi-las em contigs, ordenando e orientando-as em scaffolds ao longo de cada cromossomo.

Clinical relevance

O sequenciamento acessível tornou o sequenciamento de genoma completo e de exoma rotineiro para diagnosticar doenças hereditárias raras, perfilar tumores, identificar patógenos e rastrear recém-nascidos, transformando a determinação de sequência de um projeto marcante em um teste laboratorial padrão.

History

Sanger introduziu o sequenciamento de terminação de cadeia em 1977, o Projeto Genoma Humano aplicou estratégias clone-a-clone e "shotgun" para produzir um rascunho da sequência humana em 2001, e a chegada do sequenciamento de próxima geração em meados dos anos 2000, seguido por plataformas de leitura longa, impulsionou o custo de um genoma humano de bilhões de dólares para algumas centenas.

Key figures

• Frederick Sanger
• Eric Lander
• Craig Venter

Seminal works

• sanger1977
• lander2001

Frequently asked questions

Por que um genoma deve ser montado em vez de apenas lido diretamente?

Os instrumentos de sequenciamento só conseguem ler pequenos trechos de DNA por vez, então um genoma é quebrado em inúmeros fragmentos; o software de montagem então reconstrói a ordem original detectando onde os fragmentos se sobrepõem.

O que significa cobertura de sequenciamento?

Cobertura é o número médio de vezes que cada base no genoma é lida; uma cobertura mais alta confere maior confiança em cada chamada e ajuda a distinguir variantes verdadeiras de erros de sequenciamento.