CRISPR e Edição Genômica

Como as nucleases programáveis, especialmente os sistemas CRISPR-Cas guiados por RNA, realizam cortes direcionados no DNA que permitem aos pesquisadores editar genomas com uma facilidade sem precedentes.

Definition

Edição genômica é a alteração direcionada do DNA de um organismo em locais escolhidos usando nucleases programáveis; CRISPR-Cas é um sistema guiado por RNA, derivado da imunidade bacteriana, no qual um RNA guia direciona a nuclease Cas para uma sequência de DNA correspondente para criar uma quebra de fita dupla para edição.

Scope

Este tópico aborda a edição genômica direcionada, centrada no CRISPR-Cas. Ele trata da origem bacteriana do CRISPR como um sistema imunológico adaptativo, do princípio da clivagem de DNA guiada por RNA pela Cas9, de como a quebra resultante é reparada para deletar ou inserir sequências, e de um breve contraste com nucleases programáveis anteriores. Ele aborda o método e sua lógica; métodos mais amplos de clonagem, amplificação e sequenciamento são cobertos em tópicos complementares.

Core questions

• De onde vem o CRISPR e qual é sua função natural?
• Como um RNA guia direciona a Cas9 para uma sequência de DNA específica?
• Como a quebra de fita dupla é usada para deletar ou inserir sequências?
• Como o CRISPR se compara com ferramentas de edição genômica anteriores?

Key theories

Clivagem de DNA guiada por RNA

Jinek e colegas mostraram que a nuclease Cas9 pode ser programada por um único RNA guia para cortar qualquer sequência de DNA correspondente, transformando um sistema imunológico bacteriano em uma ferramenta de edição versátil e facilmente direcionável.

Edição direcionada por reparo

A quebra de fita dupla criada no alvo é reparada pelas próprias vias da célula, de modo que a junção de extremidades propensa a erros interrompe um gene ou o reparo dirigido por homologia introduz uma mudança definida fornecida por uma matriz.

Mechanisms

Na edição CRISPR-Cas, um RNA guia pareia-se com uma sequência de DNA alvo adjacente a um curto motivo de reconhecimento, direcionando a nuclease Cas para cortar ambas as fitas nesse local. A célula então repara a quebra: a junção de extremidades não homólogas frequentemente introduz pequenas inserções ou deleções que inativam um gene, enquanto o reparo dirigido por homologia, dada uma matriz doadora, instala uma mudança de sequência precisa. Como a especificidade é definida simplesmente pela sequência do RNA guia, o sistema é muito mais fácil de redirecionar do que as nucleases programadas por proteínas anteriores.

Clinical relevance

A edição genômica está sendo desenvolvida para terapias gênicas e celulares e é uma ferramenta de pesquisa padrão, enquanto seu uso em humanos levanta considerações éticas significativas; apresentada como significado, e não como orientação clínica.

History

Com base na descoberta de que os loci CRISPR formam um sistema imunológico adaptativo bacteriano, a demonstração de Doudna e Charpentier em 2012 de que a Cas9 pode ser programada com um único RNA guia estabeleceu a edição genômica CRISPR, reconhecida pelo Prêmio Nobel de Química de 2020.

Debates

Edição da linhagem germinativa humana

A edição de células hereditárias levanta preocupações éticas e de segurança sobre consentimento, efeitos fora do alvo e equidade; a comunidade científica tem pedido cautela enquanto as aplicações em células não hereditárias avançam.

Key figures

• Jennifer Doudna
• Emmanuelle Charpentier

Seminal works

• jinek2012
• watson2013

Frequently asked questions

O que o RNA guia faz no CRISPR?

Ele pareia-se com uma sequência de DNA correspondente e direciona a nuclease Cas para cortar ali, de modo que a alteração do guia muda o alvo.

Como o corte do DNA resulta em uma edição?

A célula repara a quebra; dependendo da via e de qualquer matriz fornecida, isso ou interrompe o gene ou introduz uma mudança precisa e intencional.