DNA 및 RNA 시퀀싱 방법

시퀀싱 방법은 DNA 또는 전환 후 RNA에서 뉴클레오타이드의 정확한 순서를 결정합니다. Sanger의 사슬 종결 화학부터 대규모 병렬 차세대 플랫폼에 이르기까지, 이러한 기술은 분자 병리학이 유전자를 염기 단위로 읽고, 돌연변이를 감지하며, 대규모로 유전자 발현을 프로파일링할 수 있도록 합니다.

Definition

DNA 및 RNA 시퀀싱 방법은 핵산 분자에서 뉴클레오타이드 염기의 선형 순서를 읽는 실험실 기술입니다. RNA는 일반적으로 시퀀싱 전에 상보적 DNA로 역전사됩니다.

Scope

이 주제는 1세대(Sanger) 시퀀싱, 차세대(대규모 병렬) 시퀀싱, 전사체 분석을 위한 RNA 시퀀싱을 다루며, 라이브러리 준비, 시퀀싱, 리드 정렬의 일반적인 워크플로우를 포함합니다. 이는 임상 테스트 지침이라기보다는 방법론적 참고 자료로 제시됩니다.

Key concepts

• 사슬 종결 (Sanger) 시퀀싱
• 차세대 / 대규모 병렬 시퀀싱
• 라이브러리 준비
• 시퀀싱 리드 및 커버리지
• 리드 정렬 및 변이 호출
• RNA 시퀀싱 (전사체학)
• 표적, 엑솜, 전장 게놈 시퀀싱

Mechanisms

Sanger 시퀀싱은 사슬 종결 다이데옥시뉴클레오타이드를 통합하여 모든 길이의 단편을 생성하며, 이 단편들은 크기별로 분리되어 서열을 재구성합니다 (Sanger et al., 1977). 반면 차세대 시퀀싱은 단편화된 DNA 라이브러리를 준비하고, 이를 공간적으로 증폭하며, 수백만 개의 단편을 병렬로 시퀀싱하여 짧은 구간을 읽고 그 신호를 계산적으로 조합합니다 (Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016). RNA 시퀀싱은 RNA에서 유래한 상보적 DNA에 동일한 병렬 접근 방식을 적용하여 전사체를 정량화하고 스플라이싱 및 발현 패턴을 밝힙니다 (Wang et al., 2009). 리드는 변이를 식별하거나 풍부도를 측정하기 위해 참조 서열에 정렬됩니다.

Clinical relevance

시퀀싱은 질병 관련 변이의 탐지 및 종양과 병원체의 분자적 특성화를 지원합니다. 이 항목은 방법들이 어떻게 서열 데이터를 생성하는지 설명하며 참고 자료로 의도되었습니다. 개별 환자 치료에서 시퀀싱 테스트를 선택, 해석 또는 조치하는 것에 대한 조언을 제공하지 않습니다.

Evidence & guidelines

이 방법들은 Sanger의 1977년 사슬 종결 방법부터 최초의 고처리량 피코리터 플랫폼 (Margulies et al., 2005) 및 인간 게놈 서열 (Venter et al., 2001)에 이르는 기초적인 1차 문헌에 기반을 두고 있으며, 이후 10년간의 차세대 기술과 RNA-Seq의 부상을 다룬 후속 검토 논문들이 있습니다 (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

History

Sanger의 사슬 종결 방법 (1977)은 DNA 시퀀싱을 일상적인 작업으로 만들었고 인간 게놈의 첫 시퀀싱 (Venter et al., 2001)의 기반이 되었습니다. 2000년대 중반 대규모 병렬 시퀀싱의 도입은 비용을 극적으로 낮추고 처리량을 높였으며 (Margulies et al., 2005), 10년 이내에 차세대 시퀀싱과 RNA-Seq는 유전체학 및 전사체학의 표준 도구가 되었습니다 (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

Key figures

• Frederick Sanger
• J. Craig Venter
• Marcel Margulies

Seminal works

• sanger-1977
• margulies-2005
• goodwin-2016

Frequently asked questions

차세대 시퀀싱은 Sanger 시퀀싱과 어떻게 다른가요?

Sanger 시퀀싱은 사슬 종결 화학을 사용하여 한 번에 하나의 DNA 단편을 읽는 반면, 차세대 시퀀싱은 대규모 병렬 방식으로 수백만 개의 단편을 동시에 읽어 처리량을 크게 늘리고 염기당 비용을 낮춥니다.

RNA를 직접 시퀀싱할 수 있나요?

RNA는 일반적으로 역전사를 통해 먼저 상보적 DNA로 전환된 다음 시퀀싱됩니다. 이 RNA-Seq 접근 방식은 전사체를 정량화하고 스플라이싱 및 발현 패턴을 밝힙니다.