Diagnostik Molekuler: PCR dan Sekuensing

Metode molekuler mendeteksi dan mengidentifikasi jamur berdasarkan asam nukleatnya, bukan berdasarkan pertumbuhan atau penampakannya. Reaksi berantai polimerase mengamplifikasi DNA jamur dari spesimen atau isolat, dan sekuensing daerah yang lestari, terutama internal transcribed spacer dari klaster gen ribosom, membaca DNA yang diamplifikasi untuk menamai organisme, seringkali lebih cepat dan lebih tepat daripada kultur.

Definition

Diagnostik molekuler untuk jamur adalah teknik yang mengamplifikasi dan menganalisis asam nukleat jamur, menggunakan PCR untuk mendeteksi DNA jamur dan sekuensing DNA dari daerah lestari seperti internal transcribed spacer untuk mengidentifikasi organisme hingga genus atau spesies.

Scope

Topik ini mencakup PCR spesifik spesies dan rentang luas (panfungal), PCR waktu nyata, sekuensing DNA dari daerah kode batang seperti ITS, dan penggunaan metode ini pada isolat kultur dan langsung pada bahan klinis, termasuk jaringan yang difiksasi formalin. Topik ini membingkai metode tersebut sebagai metode identifikasi dan deteksi dan tidak menawarkan instruksi pengujian atau pengobatan.

Core questions

• Apakah DNA jamur ada dalam spesimen ini, dan dari organisme mana asalnya?
• Kapan PCR panfungal rentang luas lebih disukai daripada uji spesifik spesies?
• Daerah genomik mana yang paling baik membedakan jamur yang diminati?
• Bagaimana hasil molekuler diinterpretasikan mengingat risiko kontaminasi dan deteksi DNA yang tidak layak?

Key concepts

• Reaksi berantai polimerase (PCR)
• PCR spesifik spesies versus rentang luas (panfungal)
• PCR waktu nyata (kuantitatif)
• Internal transcribed spacer (ITS) sebagai kode batang jamur
• Sekuensing DNA dan basis data referensi
• Deteksi pada isolat versus langsung pada jaringan
• Kontrol kontaminasi dan interpretasi DNA bebas sel

Mechanisms

PCR menggunakan primer dan polimerase termostabil untuk mengamplifikasi DNA target melalui siklus berulang, menghasilkan cukup salinan untuk mendeteksi bahkan sejumlah kecil materi genetik jamur. Uji spesifik spesies menargetkan organisme yang diketahui, sementara uji rentang luas atau panfungal menggunakan primer terhadap daerah lestari yang dimiliki oleh banyak jamur, setelah itu sekuensing mengungkapkan identitasnya. Daerah internal transcribed spacer dari klaster gen RNA ribosom, yang diapit oleh primer lestari yang dijelaskan oleh White dan rekan, cukup bervariasi antarspesies untuk bertindak sebagai kode batang jamur universal, dan urutan bacaan dicocokkan dengan basis data referensi untuk menamai organisme. PCR waktu nyata menambahkan kuantifikasi dan kecepatan, dan uji dapat dijalankan pada isolat yang dikultur atau langsung pada spesimen klinis, termasuk jaringan yang difiksasi formalin, meskipun DNA yang terdegradasi dan kontaminasi lingkungan mempersulit interpretasi. Karena PCR mendeteksi DNA daripada sel yang layak, hasilnya dibaca bersama dengan kultur, mikroskop, dan temuan antigen.

Clinical relevance

Deteksi dan sekuensing molekuler semakin mendasari bagaimana jamur diidentifikasi dan bagaimana beberapa infeksi dikenali, dan hasil PCR tertentu berkontribusi pada kategori konsensus penyakit jamur invasif yang mungkin. Entri ini menjelaskan metode dan peringatan interpretatifnya sebagai bahan referensi dan tidak mengarahkan pengujian atau perawatan pasien.

Evidence & guidelines

Definisi konsensus dari EORTC/MSGERC menggabungkan hasil PCR tertentu di antara kriteria mikologi untuk penyakit jamur invasif yang mungkin, mencerminkan kematangan metode molekuler, sementara rekomendasi praktik terbaik menjelaskan tempatnya di samping kultur dan pengujian antigen. Pendekatan sekuensing ITS berasal dari primer yang banyak digunakan yang diterbitkan oleh White dan rekan.

History

Setelah reaksi berantai polimerase dikembangkan pada tahun 1980-an, aplikasinya pada jamur berkembang pesat ketika White dan rekan menerbitkan, pada tahun 1990, primer untuk mengamplifikasi dan langsung mensekuens gen RNA ribosom jamur, menetapkan daerah ITS sebagai penanda filogenetik dan kemudian diagnostik. PCR waktu nyata, uji panfungal rentang luas, dan sekuensing throughput tinggi kemudian memperluas mikologi molekuler dari penelitian ke identifikasi dan deteksi rutin.

Seminal works

• white-1990
• donnelly-2020

Frequently asked questions

Apa itu daerah ITS dan mengapa digunakan untuk mengidentifikasi jamur?

Internal transcribed spacer (ITS) adalah bagian dari klaster gen ribosom jamur yang cukup bervariasi antarspesies sementara diapit oleh urutan lestari, menjadikannya kode batang universal yang praktis untuk identifikasi jamur berbasis sekuensing.

Apakah PCR jamur yang positif membuktikan infeksi aktif?

Tidak dengan sendirinya. PCR mendeteksi DNA jamur, yang dapat bertahan setelah organisme tidak lagi layak atau berasal dari kontaminasi, sehingga hasil molekuler diinterpretasikan bersama dengan kultur, mikroskop, dan tes antigen serta dalam definisi diagnostik standar.