PCR et amplification des acides nucléiques
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) — une méthode cyclique, dirigée par des amorces, qui copie de manière exponentielle un segment d'ADN choisi — et la famille plus large des techniques d'amplification qui en découlent.
Definition
La réaction en chaîne par polymérase est une méthode in vitro qui amplifie de manière exponentielle une région d'ADN définie par des cycles répétés de séparation des brins, d'hybridation d'amorces flanquantes et d'extension par une ADN polymérase thermostable ; l'amplification des acides nucléiques englobe plus largement les techniques apparentées de copie de séquences d'ADN ou d'ARN.
Scope
Ce sujet couvre les principes et les variantes de l'amplification des acides nucléiques : le cyclage thermique de dénaturation, d'hybridation des amorces et d'extension qui définit la réaction en chaîne par polymérase ; le rôle des amorces et de la polymérase thermostable ; et les extensions telles que la transcription inverse et l'amplification quantitative en temps réel. Il traite de la méthode et de sa logique ; le séquençage et le clonage utilisant l'ADN amplifié sont abordés dans des sujets complémentaires.
Core questions
- Comment des cycles répétés de chauffage et de refroidissement amplifient-ils une région d'ADN spécifique ?
- Pourquoi deux amorces et une polymérase thermostable sont-elles essentielles ?
- Comment l'amplification devient-elle exponentielle ?
- Comment la méthode est-elle étendue pour quantifier les acides nucléiques ou pour amplifier l'ARN ?
Key theories
- Amplification exponentielle définie par les amorces
- Une paire d'amorces flanquant la cible définit la région amplifiée, et parce que chaque nouveau brin sert de matrice dans le cycle suivant, le nombre de copies de la cible double approximativement par cycle, augmentant de manière exponentielle.
- La polymérase thermostable permet le cyclage
- L'utilisation d'une ADN polymérase thermostable permet des dénaturations répétées à haute température sans avoir à rajouter d'enzyme, rendant le cyclage thermique automatisé pratique et la réaction robuste.
Mechanisms
Chaque cycle chauffe l'échantillon pour séparer les brins d'ADN, le refroidit afin que deux amorces s'hybrident à des séquences flanquant la cible sur des brins opposés, et le réchauffe à une température d'extension à laquelle une polymérase thermostable synthétise de nouveaux brins à partir des amorces. Étant donné que les produits d'un cycle servent de matrice pour le suivant, la région cible est amplifiée de manière exponentielle sur de nombreux cycles. Les variantes incluent l'amplification par transcription inverse, qui copie d'abord l'ARN en ADN, et l'amplification quantitative en temps réel, qui surveille l'accumulation du produit pour mesurer les quantités initiales.
Clinical relevance
L'amplification est essentielle pour les tests génétiques, la détection de pathogènes et l'identification forensique ; présentée comme une signification plutôt qu'une directive clinique.
History
Mullis a conçu la réaction en chaîne par polymérase au début des années 1980, et le rapport de 1985 de Saiki et ses collègues en a démontré l'utilisation, l'adoption ultérieure de la polymérase thermostable la rendant courante ; l'invention a été reconnue par le prix Nobel de chimie en 1993.
Key figures
- Kary Mullis
- Randall Saiki
- Henry Erlich
Related topics
Seminal works
- saiki1985
- lodish2016
Frequently asked questions
- Pourquoi la PCR a-t-elle besoin d'amorces ?
- Les amorces définissent les points de départ de la synthèse sur chaque brin, elles déterminent donc quelle région est copiée et permettent à la polymérase de commencer l'extension.
- Qu'est-ce qui rend l'amplification exponentielle ?
- Les nouveaux brins de chaque cycle deviennent des matrices dans le cycle suivant, de sorte que le nombre de copies de la cible double approximativement à chaque cycle.