ADN recombinant et clonage moléculaire

Comment les enzymes de restriction, les ligases et les vecteurs sont utilisés pour couper et joindre l'ADN de différentes sources et le propager dans des cellules hôtes — la technologie fondatrice du génie génétique.

Definition

L'ADN recombinant et le clonage moléculaire désignent l'ensemble des méthodes permettant d'assembler des fragments d'ADN de différentes sources dans un vecteur et de propager la molécule résultante dans des cellules hôtes, afin qu'une séquence d'ADN choisie puisse être amplifiée, maintenue et étudiée.

Scope

Ce sujet couvre la construction de l'ADN recombinant et son clonage : les enzymes de restriction et la coupure de l'ADN à des sites spécifiques, l'assemblage de fragments avec l'ADN ligase, l'utilisation de plasmides et d'autres vecteurs, l'introduction dans des cellules hôtes, et la sélection des recombinants. Il traite des principes du clonage ; l'amplification, le séquençage et l'édition en aval sont abordés dans des sujets complémentaires.

Core questions

• Comment les enzymes de restriction coupent-elles l'ADN à des séquences spécifiques ?
• Comment les fragments d'ADN sont-ils assemblés dans un vecteur ?
• Que sont les vecteurs et comment introduisent-ils l'ADN étranger dans les cellules hôtes ?
• Comment les cellules portant la molécule recombinante désirée sont-elles sélectionnées ?

Key theories

Coupure et assemblage spécifiques à la séquence

Les enzymes de restriction reconnaissent et coupent des séquences d'ADN définies, laissant souvent des extrémités complémentaires, que l'ADN ligase peut assembler, permettant ainsi de recombiner de manière prévisible des fragments provenant de différentes sources.

Propagation par vecteur

L'insertion d'un fragment dans un vecteur réplicatif et son introduction dans des cellules hôtes permettent à l'ADN recombinant d'être copié en même temps que l'hôte, produisant ainsi de nombreux clones identiques de la séquence choisie.

Mechanisms

Une enzyme de restriction coupe à la fois l'ADN cible et un vecteur à des sites de reconnaissance spécifiques, générant fréquemment des extrémités cohésives (overhangs) simple brin complémentaires. Les fragments sont mélangés et assemblés par l'ADN ligase pour former une molécule recombinante, qui est introduite dans des cellules hôtes par transformation ou des méthodes apparentées. Étant donné que le vecteur porte une origine de réplication et des marqueurs sélectionnables, les cellules hôtes qui incorporent et maintiennent l'ADN recombinant peuvent être identifiées et cultivées, produisant de grandes quantités de la séquence clonée pour une utilisation ultérieure.

Clinical relevance

Le clonage moléculaire est à la base de la production de protéines recombinantes telles que l'insuline et les anticorps, ainsi que de la construction de vecteurs pour la thérapie génique et les vaccins ; présenté comme une signification, non comme une directive clinique.

History

La caractérisation des enzymes de restriction par Arber, Smith et Nathans, et la construction des premières molécules d'ADN recombinant par Berg, Cohen et Boyer au début des années 1970, ont établi le clonage moléculaire et leur ont valu une reconnaissance Nobel, rendant le génie génétique courant.

Key figures

• Hamilton Smith
• Daniel Nathans
• Werner Arber
• Paul Berg
• Herbert Boyer
• Stanley Cohen

Seminal works

• smith1970
• watson2013

Frequently asked questions

Que fait une enzyme de restriction ?

Elle reconnaît une courte séquence d'ADN spécifique et coupe l'ADN à cet endroit, laissant souvent des extrémités qui peuvent être assemblées à d'autres fragments coupés par la même enzyme.

Pourquoi les vecteurs sont-ils nécessaires en clonage ?

Un vecteur transporte l'ADN inséré dans les cellules hôtes et s'y réplique, de sorte que la séquence clonée est copiée et peut être sélectionnée et propagée.