تکنیک‌های تشخیص مولکولی

تکنیک‌های تشخیص مولکولی با تکثیر و شناسایی اسیدهای نوکلئیک انگل‌ها، آن‌ها را شناسایی می‌کنند و حساسیت تحلیلی بالا و توانایی تشخیص گونه‌ها، ژنوتیپ‌ها و عفونت‌های مختلطی را ارائه می‌دهند که ممکن است میکروسکوپی و سرولوژی قادر به شناسایی آن‌ها نباشند. در انگل‌شناسی، این روش‌ها از PCR معمولی و Real-time تا فرمت‌های تکثیر ایزوترمال طراحی شده برای استفاده در محل مراقبت (Point-of-Care) در محیط‌های با منابع محدود، متغیر هستند.

Definition

تکنیک‌های تشخیص مولکولی در انگل‌شناسی، روش‌های آزمایشگاهی هستند که انگل‌ها را با تکثیر و شناسایی توالی‌های اسید نوکلئیک خاص انگل، با استفاده از PCR و شیمی‌های تکثیر مرتبط، برای تأیید عفونت، تعیین نوع گونه، و تشخیص عفونت‌های با تراکم پایین یا مختلط، شناسایی و مشخص می‌کنند.

Scope

این موضوع شامل تشخیص مبتنی بر اسید نوکلئیک در انگل‌شناسی است: واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و انواع Real-time و Nested آن، روش‌های ایزوترمال مانند تکثیر ایزوترمال با واسطه حلقه (LAMP)، و استفاده از این ابزارها برای تعیین نوع گونه، تشخیص با تراکم پایین، و شناسایی عفونت‌های مختلط یا پنهان. این موضوع تشخیص مولکولی را به عنوان یک روش تشخیصی بررسی می‌کند و پروتکل‌های آزمایش بالینی یا درمانی را ارائه نمی‌دهد. برای تشخیص مولکولی در چارچوب باکتری‌شناسی، به گره مرتبط مراجعه کنید.

Core questions

• چگونه تکثیر اسید نوکلئیک به حساسیتی فراتر از میکروسکوپی و آزمایش‌های آنتی‌ژن دست می‌یابد؟
• چه زمانی تعیین نوع گونه و ژنوتیپ، نتیجه تشخیصی یا اپیدمیولوژیک را تغییر می‌دهد؟
• چه چیزی روش‌های ایزوترمال مانند LAMP را برای استفاده در محل مراقبت و در میدان مناسب می‌سازد؟
• تشخیص DNA انگل چگونه باید نسبت به عفونت فعال و زنده تفسیر شود؟

Key concepts

• واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)
• PCR Nested و Real-time (کمی)
• تکثیر ایزوترمال با واسطه حلقه (LAMP)
• تعیین نوع گونه و ژنوتیپ
• تشخیص عفونت‌های مختلط و با تراکم پایین
• حساسیت و ویژگی تحلیلی
• تشخیص DNA در مقابل قابلیت حیات ارگانیسم

Mechanisms

این روش‌ها از شناسایی توالی خاص DNA انگل بهره می‌برند. در PCR، پلیمراز مقاوم به حرارت و پرایمرهای احاطه‌کننده یک توالی هدف، تکثیر نمایی را از طریق چرخه‌های مکرر واسرشتگی (Denaturation)، اتصال (Annealing) و گسترش (Extension) هدایت می‌کنند، به طوری که حتی تعداد بسیار کمی از نسخه‌های اولیه نیز قابل تشخیص هستند؛ PCR Nested یک جفت پرایمر دوم را برای افزایش حساسیت و ویژگی اضافه می‌کند، و PCR Real-time تکثیر را در حین پیشرفت آن کمی‌سازی می‌کند. روش‌های ایزوترمال مانند LAMP، تکثیر را در یک دمای واحد با استفاده از چندین پرایمر و یک پلیمراز جابجاکننده رشته (Strand-displacing polymerase) انجام می‌دهند، که نیاز به چرخه حرارتی را از بین می‌برد و فرمت‌های ساده‌تر و قابل استقرار در میدان را امکان‌پذیر می‌سازد. از آنجا که تکثیر، اسید نوکلئیک را هدف قرار می‌دهد نه یک ارگانیسم زنده، یک نتیجه مثبت باید با این احتیاط تفسیر شود که DNA باقیمانده ممکن است پس از از بین رفتن انگل نیز باقی بماند.

Clinical relevance

تکنیک‌های مولکولی تشخیص عفونت‌های با تراکم پایین و مختلط را بهبود می‌بخشند و شناسایی گونه و ژنوتیپ را امکان‌پذیر می‌سازند که راهنمای نظارت و توصیف موارد است. این مدخل روش‌ها و محدودیت‌های تفسیری آن‌ها را به عنوان شواهد توصیف می‌کند و جایگزینی برای پروتکل‌های آزمایشگاهی یا تصمیم‌گیری بالینی نیست.

Epidemiology

با تشخیص عفونت‌ها در زیر آستانه میکروسکوپی و تفکیک مخلوط‌های گونه‌ای، روش‌های مولکولی برآوردها از ناقل بودن انگل‌های زیرمیکروسکوپی در مالاریا و سایر عفونت‌ها را بازبینی کرده‌اند، و مدل‌های انتقال و ارزیابی برنامه‌های کنترل را آگاه ساخته‌اند؛ فرمت‌های ایزوترمال به طور فزاینده‌ای برای آزمایش‌های غیرمتمرکز در محیط‌های بومی و با منابع محدود مورد بررسی قرار می‌گیرند.

History

معرفی PCR با پلیمراز مقاوم به حرارت توسط سایکی و همکاران در سال 1988، تکثیر روتین اسید نوکلئیک را عملی ساخت و بلافاصله پس از آن برای انگل‌ها سازگار شد، با آزمایش‌های PCR Nested که حساسیت تشخیص مالاریا را در اوایل دهه 1990 به طور قابل توجهی افزایش داد. توصیف تکثیر ایزوترمال با واسطه حلقه در سال 2000، مسیری را برای تشخیص‌های مولکولی با تجهیزات سبک و در محل مراقبت (Point-of-Care) باز کرد که همچنان برای بیماری‌های انگلی در حال توسعه است.

Debates

آیا تشخیص DNA انگل، عفونت فعال را اثبات می‌کند؟

تکثیر، وجود اسید نوکلئیک انگل را تأیید می‌کند اما به خودی خود نمی‌تواند ثابت کند که یک ارگانیسم زنده وجود دارد، زیرا DNA باقیمانده می‌تواند پس از پاکسازی باقی بماند؛ این امر استفاده از مثبت بودن مولکولی را به عنوان یک آزمایش درمان پیچیده می‌کند.

Seminal works

• saiki-1988
• notomi-2000
• snounou-1993

Frequently asked questions

چرا آزمایش‌های مولکولی اغلب حساس‌تر از میکروسکوپی هستند؟

تکثیر می‌تواند تعداد کمی از نسخه‌های DNA انگل را به یک سیگنال قابل تشخیص تبدیل کند، بنابراین عفونت‌هایی با تراکم انگل بسیار پایین که میکروسکوپی ممکن است آن‌ها را از دست بدهد، همچنان می‌توانند تشخیص داده شده و تا سطح گونه شناسایی شوند.

LAMP چه مزیتی نسبت به PCR معمولی دارد؟

LAMP DNA را در یک دمای ثابت و بدون نیاز به ترموسایکلر تکثیر می‌کند، که آن را ساده‌تر، سریع‌تر و مناسب‌تر برای استفاده در محل مراقبت و در میدان می‌سازد، اگرچه طراحی و تفسیر آزمایش همچنان نیازمند دقت است.