Hibridación in situ con fluorescencia (FISH)

La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) es una técnica citogenética molecular que utiliza sondas de ADN marcadas fluorescentemente para unirse a secuencias cromosómicas específicas, las cuales se visualizan directamente en los cromosomas o en los núcleos celulares bajo un microscopio de fluorescencia. Al dirigirse a loci definidos en lugar de escanear todo el genoma, FISH detecta y localiza deleciones, duplicaciones, reordenamientos y aneuploidías específicas con alta sensibilidad, incluso en células no divisoras (en interfase).

Definition

FISH es una técnica en la que una sonda de ácido nucleico marcada se hibrida con secuencias complementarias fijadas en una preparación cromosómica o núcleo celular y se detecta por fluorescencia, lo que permite identificar, contar o localizar dianas genómicas específicas.

Scope

Este tema abarca el principio de hibridación de sondas, los principales tipos de sondas y sus usos (sondas específicas de locus, centroméricas y de pintura cromosómica completa), y la aplicación de FISH a células en metafase e interfase. Es una referencia metodológica y no proporciona orientación sobre el manejo clínico.

Core questions

• ¿Cómo logra una sonda marcada una unión específica y detectable a su diana cromosómica?
• ¿Qué distingue a las sondas específicas de locus, centroméricas y de pintura cromosómica?
• ¿Por qué se puede aplicar FISH tanto a células en interfase como en metafase?
• ¿Qué anomalías dirigidas resuelve FISH que el bandeo no puede?

Key concepts

• Hibridación de ácidos nucleicos
• Sonda marcada fluorescentemente
• Sonda específica de locus
• Sonda centromérica (alfa-satélite)
• Sonda de pintura cromosómica completa
• FISH en interfase versus metafase
• Especificidad de la sonda y recuento de señales
• Detección de microdeleciones

Mechanisms

Una sonda de ADN complementaria a una secuencia diana se marca con un fluoróforo (directamente o a través de una molécula reportera). El ADN cromosómico diana en un portaobjetos y la sonda se desnaturalizan a cadenas sencillas y luego se permite que se hibriden, de modo que la sonda se une a su secuencia complementaria en su lugar. Después de lavar la sonda no unida, la señal unida se visualiza mediante microscopía de fluorescencia. Diferentes diseños de sondas sirven para distintos propósitos: las sondas específicas de locus detectan o confirman ganancias, pérdidas o reordenamientos en un gen o región definida; las sondas centroméricas cuentan copias de un cromosoma dado (enumeración de aneuploidías); y las sondas de pintura cromosómica completa marcan un cromosoma entero para caracterizar reordenamientos complejos. Debido a que la hibridación no requiere células en división, FISH se puede realizar en núcleos en interfase, extendiendo el análisis a tejidos y muestras en los que las preparaciones de metafase son difíciles de obtener.

Clinical relevance

FISH se utiliza para confirmar o excluir condiciones específicas de microdeleción y microduplicación, para enumerar aneuploidías y para detectar reordenamientos definidos, como los que caracterizan ciertos tipos de cáncer. Complementa el cariotipado al añadir una detección dirigida y de alta sensibilidad, incluso en células en interfase. Esta entrada describe cómo se generan los hallazgos de FISH; no es una base para decisiones diagnósticas o de tratamiento individuales.

Evidence & guidelines

Los hallazgos de FISH se describen dentro del Sistema Internacional para la Nomenclatura Citogenómica Humana (ISCN), que incluye la notación para las señales de las sondas y los resultados de la hibridación.

History

La hibridación in situ se desarrolló por primera vez con sondas radiactivas a finales de la década de 1960. El cambio a la detección fluorescente, demostrado cuantitativamente por Pinkel, Straume y Gray en 1986, proporcionó un método más rápido, seguro y capaz de múltiples colores, e impulsó la citogenética molecular. Los diseños de sondas posteriores y los enfoques multicolor extendieron FISH desde la detección de un solo locus hacia el análisis simultáneo de muchas dianas, uniendo la citogenética clásica y la genética molecular.

Key figures

• Daniel Pinkel
• Joe W. Gray
• Michael Speicher
• Nigel Carter

Seminal works

• pinkel-1986
• speicher-carter-2005

Frequently asked questions

¿En qué se diferencia FISH del cariotipado?

El cariotipado escanea todo el genoma a baja resolución y revela reordenamientos equilibrados y ploidía, mientras que FISH utiliza sondas marcadas para interrogar loci específicos con alta sensibilidad, incluso en células en interfase no divisoras. Son enfoques complementarios.

¿Se puede realizar FISH sin células en división?

Sí. Dado que la hibridación no depende de la condensación cromosómica, FISH se puede aplicar a núcleos en interfase, lo que permite el análisis de muestras de las que no se pueden obtener fácilmente cromosomas en metafase.