Microscopía Confocal y de Fluorescencia
La microscopía de fluorescencia obtiene imágenes de muestras excitando moléculas fluorescentes y recogiendo la luz de mayor longitud de onda que emiten, proporcionando imágenes celulares de alto contraste y molecularmente específicas. La microscopía confocal añade un orificio estenopeico (pinhole) que rechaza la luz desenfocada, produciendo secciones ópticas nítidas que pueden ensamblarse en vistas tridimensionales de la célula.
Definition
La microscopía de fluorescencia utiliza la absorción y reemisión de luz por fluoróforos para obtener imágenes de estructuras marcadas; la microscopía confocal es una técnica de fluorescencia en la que un orificio estenopeico (pinhole) excluye la luz desenfocada de modo que solo un plano delgado enfocado contribuye a cada imagen, produciendo secciones ópticas.
Scope
La entrada abarca el principio del contraste por fluorescencia, la ventaja del seccionamiento óptico de la imagen confocal y la amplia clase de métodos de superresolución que llevan la imagen de fluorescencia por debajo del límite de difracción. Se tratan estos como métodos de imagenología dentro de la biología celular y no como instrucción clínica.
Core questions
- ¿Cómo proporciona la fluorescencia contraste molecular en una célula?
- ¿Cómo produce un orificio estenopeico (pinhole) confocal secciones ópticas?
- ¿Cómo se reconstruyen las imágenes tridimensionales de las células?
- ¿Cómo superan los métodos de superresolución el límite de difracción?
Key concepts
- Excitación y emisión de fluorescencia
- Fluoróforos y proteínas fluorescentes
- Orificio estenopeico (pinhole) confocal y seccionamiento óptico
- Reconstrucción tridimensional
- Fotoblanqueo y fototoxicidad
- Imagenología de superresolución (sin límite de difracción)
Mechanisms
En la microscopía de fluorescencia, un fluoróforo absorbe luz de excitación y reemite a una longitud de onda más larga, la cual se separa de la excitación mediante filtros para proporcionar un contraste brillante y específico sobre un fondo oscuro, como revisaron Lichtman y Conchello. Sin embargo, una imagen de fluorescencia convencional contiene luz borrosa proveniente de por encima y por debajo del plano focal; la microscopía confocal coloca un orificio estenopeico (pinhole) conjugado al punto focal para que la luz desenfocada sea rechazada, produciendo las secciones ópticas descritas por Conchello y Lichtman que pueden apilarse en tres dimensiones. Dado que la emisión, como toda la microscopía de luz, sigue sujeta al límite de difracción, enfoques de superresolución como la microscopía de agotamiento por emisión estimulada (stimulated-emission-depletion microscopy), introducida por Hell y Wichmann, manipulan el proceso de fluorescencia en sí mismo para resolver detalles muy por debajo de ese límite, como fue examinado por Schermelleh y sus colegas.
Clinical relevance
La microscopía confocal y de fluorescencia se utilizan ampliamente en patología, oftalmología e investigación biomédica para localizar moléculas y obtener imágenes de tejidos en tres dimensiones. Esta entrada explica los principios de imagenología involucrados y tiene un propósito educativo de referencia, no siendo una base para decisiones individuales de diagnóstico o tratamiento.
History
El principio confocal fue concebido por Marvin Minsky en la década de 1950, pero los microscopios confocales de barrido láser prácticos y los fluoróforos sintéticos y genéticamente codificados brillantes hicieron que la imagenología por fluorescencia fuera dominante en la biología celular desde finales del siglo XX. La posterior superación del límite de difracción por la microscopía de agotamiento por emisión estimulada (Hell & Wichmann, 1994) y técnicas relacionadas abrió la era de la imagenología de fluorescencia de superresolución, resumida por Schermelleh y sus colegas.
Key figures
- Jeff Lichtman
- Jose-Angel Conchello
- Stefan Hell
- Marvin Minsky
Related topics
Seminal works
- lichtman-2005
- conchello-2005
- hell-1994
- schermelleh-2010
Frequently asked questions
- ¿Qué hace el orificio estenopeico (pinhole) confocal?
- Se posiciona de modo que la luz proveniente de fuera del plano focal sea bloqueada, dejando solo la luz enfocada para formar la imagen; esto produce una sección óptica delgada que puede combinarse con otras para formar una vista tridimensional.
- ¿Cómo puede la microscopía de fluorescencia superar el límite de difracción?
- Los métodos de superresolución, como la microscopía de agotamiento por emisión estimulada, controlan el proceso de emisión de fluorescencia para que se puedan resolver detalles muy por debajo del límite de difracción clásico.