تسلسل الحمض النووي (DNA Sequencing)

كيفية تحديد ترتيب القواعد في الحمض النووي (DNA) — من طريقة إنهاء السلسلة (Sanger) إلى التقنيات المتوازية على نطاق واسع التي تقرأ الجينومات بأكملها.

Definition

تسلسل الحمض النووي (DNA sequencing) هو تحديد الترتيب الدقيق للنيوكليوتيدات في جزيء الحمض النووي، وقد تم تحقيق ذلك تاريخيًا عن طريق تخليق إنهاء السلسلة، ويتم الآن بشكل أساسي بواسطة طرق متوازية على نطاق واسع تقرأ العديد من الشظايا في وقت واحد.

Scope

يغطي هذا الموضوع طرق قراءة تسلسل النيوكليوتيدات في الحمض النووي (DNA): طريقة إنهاء السلسلة (Sanger) ومبدأها في الإنهاء الخاص بالقاعدة، والأساليب عالية الإنتاجية والمتوازية على نطاق واسع التي تلتها وجعلت تسلسل الجينوم أمرًا روتينيًا. يتناول منطق التسلسل؛ وتتم تغطية التضخيم والاستنساخ اللذين يُعدّان الحمض النووي للتسلسل في مواضيع مصاحبة.

Core questions

• كيف تكشف طريقة تسلسل إنهاء السلسلة عن ترتيب القواعد؟
• لماذا جعلت ثنائي ديوكسي نيوكليوتيدات الموسومة التسلسل عمليًا؟
• كيف تعمل الطرق المتوازية على نطاق واسع على توسيع نطاق التسلسل ليشمل الجينومات بأكملها؟
• كيف يتم تجميع القراءات القصيرة في تسلسلات وجينومات أطول؟

Key theories

تسلسل إنهاء السلسلة

يؤدي التخليق في وجود ثنائي ديوكسي نيوكليوتيدات التي تنهي السلسلة إلى إنتاج مجموعة من الشظايا تنتهي عند كل تكرار لقاعدة معينة، ويكشف ترتيب هذه الشظايا حسب الطول عن التسلسل، كما قدمه سانغر وزملاؤه.

التسلسل المتوازي على نطاق واسع

أدت قراءة أعداد هائلة من شظايا الحمض النووي في وقت واحد وإعادة بناء التسلسل حسابيًا إلى خفض التكلفة وزيادة الإنتاجية بشكل كبير، مما أتاح تسلسل الجينوم على نطاق واسع بشكل روتيني.

Mechanisms

في تسلسل إنهاء السلسلة، يتم تمديد بادئ (primer) على طول قالب (template) في وجود نيوكليوتيدات عادية بالإضافة إلى نسبة صغيرة من ثنائي ديوكسي نيوكليوتيدات (dideoxynucleotides) التي، بمجرد دمجها، توقف التخليق؛ والنتيجة هي مجموعة متداخلة من الشظايا التي تُعرف قاعدتها الطرفية، والتي يتم فصلها حسب الحجم لقراءة التسلسل. تعمل المنصات الحديثة المتوازية على نطاق واسع على تثبيت وتضخيم العديد من شظايا القالب وتكتشف دمج القواعد عبرها جميعًا في وقت واحد، مما يولد أعدادًا كبيرة من القراءات القصيرة التي تقوم البرامج بمحاذاتها أو تجميعها في التسلسل الكامل.

Clinical relevance

يُعد التسلسل أساسًا للتشخيص الجيني، وعلم جينوم السرطان، ومراقبة مسببات الأمراض، والأساليب الشخصية للطب؛ ويُقدم كأهمية، وليس إرشادًا سريريًا.

History

جعلت طريقة إنهاء السلسلة (Sanger) والطريقة الكيميائية المتوازية (Maxam–Gilbert)، وكلاهما من سبعينيات القرن الماضي، تسلسل الحمض النووي ممكنًا وحصلتا على تقدير جائزة نوبل؛ وقد أدى ظهور التقنيات المتوازية على نطاق واسع في الألفينيات إلى خفض التكاليف بمقادير كبيرة ودشن عصر الجينوم.

Key figures

• Frederick Sanger
• Walter Gilbert

Seminal works

• sanger1977
• lodish2016

Frequently asked questions

ما هو ثنائي ديوكسي نيوكليوتيد ولماذا يستخدم في التسلسل؟

إنه نيوكليوتيد معدل، بمجرد إضافته، يوقف المزيد من التخليق؛ يؤدي دمجه في مواقع عشوائية إلى توليد شظايا تنتهي عند كل قاعدة، مما يكشف عن التسلسل.

كيف يمكن تسلسل الجينومات بأكملها بهذه السرعة الآن؟

تقرأ المنصات المتوازية على نطاق واسع ملايين شظايا الحمض النووي في وقت واحد وتستخدم البرامج لتجميعها، مما يزيد السرعة ويخفض التكلفة بشكل كبير مقارنة بالطرق السابقة.