طرق وتقنيات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA)

يقيس تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) التعبير الجيني (transcriptome) عن طريق تحويل الحمض النووي الريبوزي (RNA) إلى مكتبة تسلسل وعدّ القراءات الناتجة التي تتطابق مع الجينات والنسخ. ومن خلال أخذ عينات من النسخ مباشرة بدلاً من تهجينها بمجسات محددة مسبقًا، يمكن لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) تحديد كمية التعبير عبر نطاق ديناميكي واسع، واكتشاف النسخ غير الموصوفة سابقًا ومواقع الربط، وتحديد بنية الأشكال المتساوية (isoform structure).

Definition

تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA sequencing) هو نهج تسلسل عالي الإنتاجية يتم فيه نسخ الحمض النووي الريبوزي (RNA) عكسيًا (أو تسلسله مباشرة) ويتم مطابقة القراءات الناتجة وعدّها لتحديد وفرة النسخ وتوصيف بنية النسخ عبر التعبير الجيني (transcriptome).

Scope

يغطي هذا الموضوع سير العمل التجريبي والحسابي لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq): اختيار الحمض النووي الريبوزي (RNA) وتحضير المكتبة، وكيمياء التسلسل للقراءات القصيرة والطويلة، ومحاذاة القراءات أو المحاذاة الزائفة، وتحديد الكمية وتطبيع التعبير. وهو مرجع منهجي ضمن دراسة التعبير الجيني (transcriptomics) ولا يقدم إرشادات سريرية.

Core questions

• كيف يتم تحويل عينة الحمض النووي الريبوزي (RNA) إلى مكتبة تسلسل، وما هي خطوات الاختيار (متعدد الأدينين أو استنفاد الريبوسومي) التي تشكل ما يتم قياسه؟
• كيف تتم محاذاة القراءات أو محاذاتها زائفًا مع مرجع، وتحديد كميتها لكل جين أو نسخة؟
• كيف يتم إجراء التطبيع بحيث يمكن مقارنة التعبير عبر العينات؟
• ماذا تضيف تقنيات القراءة الطويلة والحمض النووي الريبوزي المباشر على تسلسل القراءات القصيرة؟

Key concepts

• تحضير المكتبة واختيار متعدد الأدينين أو استنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي
• تسلسل القراءات القصيرة مقابل تسلسل القراءات الطويلة
• محاذاة القراءات والمحاذاة الزائفة
• عدّ القراءات وتحديد الكمية
• التطبيع (على سبيل المثال، وحدات مثل FPKM/TPM)
• عمق التسلسل والتغطية
• الكشف عن مواقع الربط
• تسلسل الحمض النووي الريبوزي المباشر

Mechanisms

في سير العمل النموذجي، يتم استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) ويتم اختيار مجموعة فرعية (عادةً الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينيلات، أو الحمض النووي الريبوزي الكلي بعد استنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي)، وتجزئتها، ونسخها عكسيًا إلى حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين مكمل (complementary DNA)، وبناء مكتبة مرتبطة بمهايئ (adapter-ligated library). يتم تسلسل المكتبة لإنتاج ملايين القراءات، والتي تتم محاذاتها مع جينوم مرجعي أو تعبير جيني (transcriptome)، أو تحديد كميتها عن طريق محاذاة زائفة خالية من المحاذاة. يتم عدّ القراءات المتداخلة مع كل ميزة؛ ولأن النسخ الأطول والعينات التي تم تسلسلها بعمق أكبر تجمع المزيد من القراءات، يتم تطبيع العدّ لطول النسخ وحجم المكتبة قبل مقارنة الوفرة. قدم Mortazavi وزملاؤه الإطار الأساسي للعدّ والتطبيع، وحددت المراجعات التي أجراها Wang و Ozsolak نقاط القوة والقيود في المنصة. تقوم تقنيات القراءة الطويلة والحمض النووي الريبوزي المباشر بتسلسل الجزيئات كاملة الطول، مما يحسن دقة الأشكال المتساوية (isoform resolution) على حساب خطأ أعلى لكل قراءة وإنتاجية أقل.

Clinical relevance

يولد تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) الكثير من أدلة التصنيف الجزيئي واكتشاف المؤشرات الحيوية في أبحاث وعلم الجينوم الانتقالي، ويدعم بشكل متزايد الكشف التشخيصي عن النسخ والاندماج. كموضوع مرجعي، فإنه يشرح كيفية إنتاج أدلة التعبير الجيني (transcriptomic evidence)؛ وهو ليس أساسًا لقرارات التشخيص أو العلاج الفردية.

Evidence & guidelines

تستمد أطر أفضل الممارسات لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) من العمل الأساسي لتحديد الكمية الذي قام به Mortazavi وزملاؤه ومن مراجعات المنهجية (Wang وزملاؤه؛ Ozsolak و Milos). يضيف تحليل القراءات الطويلة اعتباراته الخاصة، والتي استعرضها Amarasinghe وزملاؤه. هذه مراجع منهجية وليست إرشادات للممارسة السريرية.

History

ظهر تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) في عام 2008 عندما تم تطبيق تسلسل القراءات القصيرة عالي الإنتاجية على الحمض النووي الريبوزي المنسوخ عكسيًا، حيث أثبت Mortazavi وزملاؤه كيفية رسم خرائط وتحديد كمية التعبير الجيني للثدييات (mammalian transcriptomes) من عدّ القراءات. عززت المراجعات على مدى السنوات التالية معايير تحضير المكتبة والتحليل، ومنذ منتصف عام 2010، وسعت منصات القراءة الطويلة والحمض النووي الريبوزي المباشر النهج نحو تسلسل الأشكال المتساوية كاملة الطول.

Debates

تسلسل القراءات القصيرة مقابل تسلسل القراءات الطويلة

توفر القراءات القصيرة إنتاجية عالية وخطأ منخفضًا لكل قاعدة ولكنها تعيد بناء الأشكال المتساوية بشكل غير مباشر فقط، في حين تقوم القراءات الطويلة بتسلسل النسخ كاملة الطول وتحدد الأشكال المتساوية مباشرة على حساب معدلات خطأ أعلى وعمق أقل؛ يعتمد الاختيار المناسب على ما إذا كانت الأولوية هي التحديد الدقيق للكمية أو بنية الأشكال المتساوية.

Key figures

• Barbara Wold
• Ali Mortazavi
• Michael Snyder

Seminal works

• mortazavi-2008
• wang-2009
• ozsolak-2011

Frequently asked questions

ما الفرق بين اختيار متعدد الأدينين واستنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي؟

يحتجز اختيار متعدد الأدينين الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينيلات وهو فعال للنسخ المشفرة للبروتين، بينما يزيل استنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي الوفير مع الاحتفاظ بالنسخ غير متعددة الأدينيلات والمتدهورة. يحدد الاختيار أنواع الحمض النووي الريبوزي التي يمكن للتجربة قياسها.

لماذا يتم تطبيع عدّ تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) قبل المقارنة؟

تعتمد عدّ القراءات الخام على طول النسخ وعلى مدى عمق تسلسل كل عينة، لذلك لا يمكن مقارنتها مباشرة. يقوم التطبيع بتعديل هذه العوامل بحيث تعكس الاختلافات في الوفرة البيولوجيا بدلاً من العمق التقني أو الطول.