Giải trình tự hệ phiên mã không gian và đơn bào

Giải trình tự hệ phiên mã đơn bào đo lường biểu hiện gen trong từng tế bào riêng lẻ thay vì trong mô tổng thể, tiết lộ tính không đồng nhất mà việc lấy trung bình trên nhiều tế bào che khuất. Trong khi đó, giải trình tự hệ phiên mã không gian giữ lại vị trí của mỗi phép đo trong một lát cắt mô. Cùng với nhau, chúng cho phép đọc hệ phiên mã từng tế bào một và, ngày càng nhiều, tại chỗ (in situ), làm lộ rõ các loại tế bào, trạng thái tế bào khác biệt và sự tổ chức của chúng trong các mô.

Definition

Giải trình tự hệ phiên mã đơn bào định lượng các bản phiên mã RNA trong từng tế bào riêng lẻ, và giải trình tự hệ phiên mã không gian đo lường sự phong phú của bản phiên mã trong khi vẫn giữ được vị trí hai chiều của mỗi phép đo trong một mô, để biểu hiện có thể được phân tích trên mỗi tế bào và trong bối cảnh giải phẫu.

Scope

Chủ đề này bao gồm cách hệ phiên mã được thu nhận từ các tế bào đơn lẻ (phân lập tế bào, gắn mã vạch và giải trình tự), các bước tính toán biến dữ liệu thưa thớt trên mỗi tế bào thành bản đồ loại tế bào (phân cụm và giảm chiều), và các phương pháp không gian bảo toàn vị trí mô. Đây là một tài liệu tham khảo về phương pháp luận trong lĩnh vực giải trình tự hệ phiên mã và không cung cấp hướng dẫn lâm sàng.

Core questions

• RNA được thu nhận và dán nhãn duy nhất từ hàng nghìn tế bào riêng lẻ song song như thế nào?
• Các hồ sơ đơn bào thưa thớt được phân cụm thành các loại và trạng thái tế bào như thế nào?
• Các phương pháp không gian có thể bảo toàn vị trí trong mô mà mỗi bản phiên mã được đo như thế nào?
• Những hiện vật kỹ thuật nào (dropout, doublets, batch effects) mà phân tích phải tính đến?

Key concepts

• Phân lập tế bào và thu nhận dựa trên giọt
• Gắn mã vạch tế bào và định danh phân tử duy nhất
• Tính thưa thớt và dropout
• Giảm chiều và phân cụm
• Nhận dạng loại tế bào và trạng thái tế bào
• Phân tích quỹ đạo và thời gian giả
• Giải trình tự hệ phiên mã phân giải không gian
• Hiệu ứng lô và tích hợp

Mechanisms

Trong giải trình tự RNA đơn bào, các tế bào riêng lẻ được tách ra — thường bằng cách bao bọc trong các giọt — và các bản phiên mã của mỗi tế bào được gắn thẻ bằng mã vạch đặc trưng cho tế bào và thường là một định danh phân tử duy nhất trước khi giải trình tự gộp, để các đọc có thể được gán lại cho tế bào gốc của chúng và được đếm mà không có sai lệch khuếch đại. Bởi vì mỗi tế bào tạo ra ít RNA, các ma trận thu được thưa thớt và nhiễu: không phải mọi gen biểu hiện đều được phát hiện (dropout), và phân tích dựa vào việc giảm chiều và phân cụm để nhóm các tế bào thành các loại và trạng thái, như Zeisel và các đồng nghiệp đã làm cho não chuột. Tang và các đồng nghiệp lần đầu tiên chứng minh việc giải trình tự toàn bộ hệ phiên mã của một tế bào đơn lẻ, thiết lập phương pháp này. Giải trình tự hệ phiên mã không gian, được giới thiệu bởi Stahl và các đồng nghiệp, đặt các lát cắt mô lên các mảng điểm bắt giữ được gắn mã vạch vị trí để biểu hiện có thể được ánh xạ trở lại kiến trúc mô, liên kết các hồ sơ phân tử với giải phẫu.

Clinical relevance

Giải trình tự hệ phiên mã đơn bào và không gian đang định hình lại các bản đồ tham chiếu của các mô trong quá trình phát triển, miễn dịch học và ung thư học bằng cách làm rõ thành phần tế bào và tổ chức không gian của mô bình thường và mô bệnh. Là một chủ đề tham khảo, mục này giải thích cách bằng chứng biểu hiện được phân giải theo tế bào được tạo ra; nó không phải là cơ sở cho các quyết định chẩn đoán hoặc điều trị cá nhân.

Evidence & guidelines

Các điểm tham chiếu về phương pháp luận bao gồm giải trình tự hệ phiên mã đơn bào đầu tiên (Tang và các đồng nghiệp), các nghiên cứu phân loại tế bào quy mô lớn (Zeisel và các đồng nghiệp), và sự ra đời của giải trình tự hệ phiên mã không gian dựa trên mảng (Stahl và các đồng nghiệp). Đây là các tài liệu tham khảo về phương pháp luận chứ không phải là hướng dẫn lâm sàng.

History

Giải trình tự hệ phiên mã đơn bào bắt đầu vào năm 2009 khi Tang và các đồng nghiệp giải trình tự hệ phiên mã của một tế bào. Đến giữa những năm 2010, phương pháp gắn mã vạch dựa trên giọt đã mở rộng quy mô tiếp cận lên hàng nghìn tế bào, cho phép khám phá loại tế bào một cách có hệ thống như bản đồ não của Zeisel và các đồng nghiệp. Năm 2016, Stahl và các đồng nghiệp đã giới thiệu giải trình tự hệ phiên mã không gian dựa trên mảng, và các phương pháp không gian dựa trên hình ảnh và giải trình tự sau đó đã mở rộng độ phân giải và độ bao phủ gen, bổ sung cho các sáng kiến bản đồ tế bào quy mô lớn.

Debates

Độ phân giải so với độ bao phủ hệ phiên mã trong các phương pháp không gian

Các phương pháp không gian dựa trên hình ảnh có thể đạt độ phân giải gần đơn bào hoặc dưới tế bào nhưng thường đo một bảng gen giới hạn, được xác định trước, trong khi các phương pháp thu nhận dựa trên giải trình tự bao phủ toàn bộ hệ phiên mã ở độ phân giải không gian thô hơn; sự đánh đổi giữa độ phân giải và độ rộng vẫn là một câu hỏi thiết kế đang được nghiên cứu tích cực.

Key figures

• M. Azim Surani
• Sten Linnarsson
• Joakim Frisen
• Fuchou Tang

Seminal works

• tang-2009
• zeisel-2015
• stahl-2016

Frequently asked questions

Tại sao dữ liệu biểu hiện đơn bào lại thưa thớt như vậy?

Mỗi tế bào chỉ chứa một lượng nhỏ RNA, vì vậy nhiều gen thực sự được biểu hiện không được thu nhận trong bất kỳ tế bào nào (dropout). Điều này làm cho các hồ sơ trên mỗi tế bào bị nhiễu và không đầy đủ, đó là lý do tại sao phân tích dựa vào việc nhóm nhiều tế bào lại với nhau thông qua phân cụm.

Giải trình tự hệ phiên mã không gian khác với giải trình tự RNA đơn bào như thế nào?

Giải trình tự RNA đơn bào phân tách mô, vì vậy các tế bào được lập hồ sơ riêng lẻ nhưng mất vị trí ban đầu của chúng. Giải trình tự hệ phiên mã không gian đo lường biểu hiện trong khi vẫn giữ được vị trí trong mô mà mỗi phép đo đến từ đó, cho phép các hồ sơ phân tử được đặt trở lại trong bối cảnh giải phẫu.