Các Phương Pháp Giải Trình Tự DNA và RNA

Các phương pháp giải trình tự xác định trình tự chính xác của các nucleotide trong DNA hoặc, sau khi chuyển đổi, trong RNA. Từ hóa học kết thúc chuỗi của Sanger đến các nền tảng thế hệ tiếp theo song song hóa cao, các kỹ thuật này cho phép bệnh học phân tử đọc gen từng base, phát hiện đột biến và lập hồ sơ biểu hiện gen ở quy mô lớn.

Definition

Các phương pháp giải trình tự DNA và RNA là các kỹ thuật trong phòng thí nghiệm đọc trình tự tuyến tính của các base nucleotide trong một phân tử axit nucleic; RNA thường được phiên mã ngược thành DNA bổ sung trước khi giải trình tự.

Scope

Chủ đề này bao gồm giải trình tự thế hệ đầu tiên (Sanger), giải trình tự thế hệ tiếp theo (song song hóa cao), và giải trình tự RNA để phân tích hệ phiên mã, cùng với quy trình làm việc chung của việc chuẩn bị thư viện, giải trình tự và căn chỉnh các đoạn đọc. Nó được trình bày như tài liệu tham khảo về phương pháp luận hơn là hướng dẫn xét nghiệm lâm sàng.

Key concepts

• Giải trình tự kết thúc chuỗi (Sanger)
• Giải trình tự thế hệ tiếp theo / song song hóa cao
• Chuẩn bị thư viện
• Các đoạn đọc giải trình tự và độ phủ
• Căn chỉnh đoạn đọc và gọi biến thể
• Giải trình tự RNA (hệ phiên mã học)
• Giải trình tự đích, exome và toàn bộ bộ gen

Mechanisms

Giải trình tự Sanger kết hợp các dideoxynucleotide kết thúc chuỗi để tạo ra các đoạn có mọi độ dài, sau đó được tách theo kích thước để tái tạo trình tự (Sanger et al., 1977). Giải trình tự thế hệ tiếp theo thay vào đó chuẩn bị một thư viện DNA đã được cắt nhỏ, khuếch đại nó theo không gian và giải trình tự hàng triệu đoạn song song, đọc các đoạn ngắn có tín hiệu được lắp ráp bằng máy tính (Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016). Giải trình tự RNA áp dụng cùng một phương pháp song song cho DNA bổ sung có nguồn gốc từ RNA, định lượng các bản phiên mã và tiết lộ các mẫu nối và biểu hiện (Wang et al., 2009). Các đoạn đọc được căn chỉnh với một tham chiếu để xác định các biến thể hoặc đo lường sự phong phú.

Clinical relevance

Giải trình tự hỗ trợ phát hiện các biến thể liên quan đến bệnh và đặc tính phân tử của khối u và mầm bệnh. Mục này giải thích cách các phương pháp tạo ra dữ liệu trình tự và được dùng làm tài liệu tham khảo; nó không đưa ra lời khuyên về việc lựa chọn, diễn giải hoặc hành động dựa trên các xét nghiệm giải trình tự trong chăm sóc bệnh nhân cá thể.

Evidence & guidelines

Các phương pháp này dựa trên một tài liệu cơ bản ban đầu, từ phương pháp kết thúc chuỗi của Sanger năm 1977 đến nền tảng picolitre thông lượng cao đầu tiên (Margulies et al., 2005) và trình tự bộ gen người (Venter et al., 2001), với các đánh giá sau này khảo sát một thập kỷ công nghệ thế hệ tiếp theo và sự phát triển của RNA-Seq (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

History

Phương pháp kết thúc chuỗi của Sanger (1977) đã làm cho việc giải trình tự DNA trở nên thường quy và là nền tảng cho việc giải trình tự bộ gen người đầu tiên (Venter et al., 2001). Việc giới thiệu giải trình tự song song hóa cao vào giữa những năm 2000 đã giảm đáng kể chi phí và tăng thông lượng (Margulies et al., 2005), và trong vòng một thập kỷ, giải trình tự thế hệ tiếp theo và RNA-Seq đã trở thành công cụ tiêu chuẩn cho bộ gen học và hệ phiên mã học (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

Key figures

• Frederick Sanger
• J. Craig Venter
• Marcel Margulies

Seminal works

• sanger-1977
• margulies-2005
• goodwin-2016

Frequently asked questions

Giải trình tự thế hệ tiếp theo khác với giải trình tự Sanger như thế nào?

Giải trình tự Sanger đọc một đoạn DNA tại một thời điểm bằng hóa học kết thúc chuỗi, trong khi giải trình tự thế hệ tiếp theo đọc hàng triệu đoạn đồng thời theo cách song song hóa cao, làm tăng đáng kể thông lượng và giảm chi phí trên mỗi base.

RNA có thể được giải trình tự trực tiếp không?

RNA thường được chuyển đổi thành DNA bổ sung bằng phiên mã ngược trước khi giải trình tự; phương pháp RNA-Seq này định lượng các bản phiên mã và tiết lộ các mẫu nối và biểu hiện.