Các Phương Pháp và Công Nghệ Giải Trình Tự RNA

Giải trình tự RNA (RNA-seq) đo lường hệ phiên mã bằng cách chuyển đổi RNA thành thư viện giải trình tự và đếm các đọc (reads) thu được khớp với gen và bản phiên mã. Bằng cách lấy mẫu các bản phiên mã trực tiếp thay vì lai chúng với các đầu dò được xác định trước, RNA-seq có thể định lượng biểu hiện trên một dải động rộng, khám phá các bản phiên mã và điểm nối (splice junctions) chưa được chú thích trước đây, và phân giải cấu trúc đồng dạng (isoform).

Definition

Giải trình tự RNA là một phương pháp giải trình tự thông lượng cao, trong đó RNA được phiên mã ngược (hoặc giải trình tự trực tiếp) và các đọc thu được được căn chỉnh và đếm để định lượng sự phong phú của bản phiên mã và đặc trưng hóa cấu trúc bản phiên mã trên toàn bộ hệ phiên mã.

Scope

Chủ đề này bao gồm quy trình làm việc thực nghiệm và tính toán của RNA-seq: lựa chọn RNA và chuẩn bị thư viện, hóa học giải trình tự đọc ngắn và đọc dài, căn chỉnh đọc hoặc căn chỉnh giả, và định lượng và chuẩn hóa biểu hiện. Đây là một tài liệu tham khảo về phương pháp luận trong lĩnh vực hệ phiên mã và không cung cấp hướng dẫn lâm sàng.

Core questions

• Làm thế nào một mẫu RNA được biến thành thư viện giải trình tự, và những bước chọn lọc nào (poly-A hoặc loại bỏ ribosom) định hình những gì được đo lường?
• Các đọc được căn chỉnh hoặc căn chỉnh giả với một tham chiếu như thế nào, và được định lượng theo từng gen hoặc bản phiên mã ra sao?
• Việc chuẩn hóa được thực hiện như thế nào để có thể so sánh biểu hiện giữa các mẫu?
• Các công nghệ đọc dài và RNA trực tiếp bổ sung những gì so với giải trình tự đọc ngắn?

Key concepts

• Chuẩn bị thư viện và chọn lọc poly-A hoặc loại bỏ rRNA
• Giải trình tự đọc ngắn so với đọc dài
• Căn chỉnh đọc và căn chỉnh giả
• Đếm đọc và định lượng
• Chuẩn hóa (ví dụ, các đơn vị như FPKM/TPM)
• Độ sâu giải trình tự và độ phủ
• Phát hiện điểm nối (splice-junction)
• Giải trình tự RNA trực tiếp

Mechanisms

Trong một quy trình làm việc điển hình, RNA được chiết xuất và một tập hợp con được chọn (thường là RNA thông tin có đuôi poly-adenyl, hoặc tổng RNA sau khi loại bỏ RNA ribosom), được cắt nhỏ, phiên mã ngược thành DNA bổ sung, và được xây dựng thành một thư viện gắn adapter. Thư viện được giải trình tự để tạo ra hàng triệu đọc, sau đó được căn chỉnh với bộ gen hoặc hệ phiên mã tham chiếu, hoặc được định lượng bằng căn chỉnh giả không cần căn chỉnh. Các đọc chồng lấp với mỗi đặc điểm được đếm; vì các bản phiên mã dài hơn và các mẫu được giải trình tự sâu hơn sẽ tích lũy nhiều đọc hơn, số lượng đọc được chuẩn hóa theo độ dài bản phiên mã và kích thước thư viện trước khi so sánh sự phong phú. Mortazavi và các đồng nghiệp đã giới thiệu khung định lượng và chuẩn hóa cốt lõi, và các bài đánh giá của Wang và Ozsolak đã trình bày những điểm mạnh và hạn chế của nền tảng này. Các công nghệ đọc dài và RNA trực tiếp giải trình tự các phân tử toàn chiều dài, cải thiện độ phân giải đồng dạng với chi phí lỗi trên mỗi đọc cao hơn và thông lượng thấp hơn.

Clinical relevance

RNA-seq tạo ra phần lớn bằng chứng phân loại phân tử và khám phá dấu ấn sinh học trong nghiên cứu và gen học chuyển dịch, và ngày càng hỗ trợ phát hiện bản phiên mã và sự hợp nhất (fusion) chẩn đoán. Là một chủ đề tham khảo, nó giải thích cách bằng chứng hệ phiên mã được tạo ra; nó không phải là cơ sở cho các quyết định chẩn đoán hoặc điều trị cá nhân.

Evidence & guidelines

Các khung thực hành tốt nhất cho RNA-seq bắt nguồn từ công trình định lượng nền tảng của Mortazavi và các đồng nghiệp và từ các đánh giá phương pháp (Wang và các đồng nghiệp; Ozsolak và Milos). Phân tích đọc dài bổ sung các cân nhắc riêng, được khảo sát bởi Amarasinghe và các đồng nghiệp. Đây là các tài liệu tham khảo về phương pháp luận chứ không phải hướng dẫn thực hành lâm sàng.

History

RNA-seq xuất hiện vào năm 2008 khi giải trình tự đọc ngắn thông lượng cao được áp dụng cho RNA phiên mã ngược, với Mortazavi và các đồng nghiệp thiết lập cách lập bản đồ và định lượng hệ phiên mã động vật có vú từ số lượng đọc. Các bài đánh giá trong những năm tiếp theo đã củng cố các tiêu chuẩn chuẩn bị thư viện và phân tích, và từ giữa những năm 2010, các nền tảng đọc dài và RNA trực tiếp đã mở rộng phương pháp này hướng tới giải trình tự đồng dạng toàn chiều dài.

Debates

Giải trình tự đọc ngắn so với đọc dài

Đọc ngắn mang lại thông lượng cao và lỗi trên mỗi base thấp nhưng chỉ tái tạo các đồng dạng một cách gián tiếp, trong khi đọc dài giải trình tự các bản phiên mã toàn chiều dài và phân giải các đồng dạng trực tiếp với chi phí tỷ lệ lỗi cao hơn và độ sâu thấp hơn; lựa chọn phù hợp phụ thuộc vào việc ưu tiên định lượng chính xác hay cấu trúc đồng dạng.

Key figures

• Barbara Wold
• Ali Mortazavi
• Michael Snyder

Seminal works

• mortazavi-2008
• wang-2009
• ozsolak-2011

Frequently asked questions

Sự khác biệt giữa chọn lọc poly-A và loại bỏ RNA ribosom là gì?

Chọn lọc poly-A thu giữ RNA thông tin có đuôi polyadenyl và hiệu quả cho các bản phiên mã mã hóa protein, trong khi loại bỏ RNA ribosom loại bỏ rRNA phong phú đồng thời giữ lại các bản phiên mã không có đuôi polyadenyl và bị phân hủy. Lựa chọn này quyết định loại RNA nào mà thí nghiệm có thể đo lường.

Tại sao số lượng đọc RNA-seq được chuẩn hóa trước khi so sánh?

Số lượng đọc thô phụ thuộc vào độ dài bản phiên mã và mức độ sâu mà mỗi mẫu được giải trình tự, vì vậy chúng không thể được so sánh trực tiếp. Chuẩn hóa điều chỉnh các yếu tố này để sự khác biệt về sự phong phú phản ánh sinh học chứ không phải độ sâu kỹ thuật hoặc độ dài.