Kỹ thuật chẩn đoán phân tử

Các kỹ thuật chẩn đoán phân tử phát hiện ký sinh trùng bằng cách khuếch đại và nhận diện axit nucleic của chúng, mang lại độ nhạy phân tích cao và khả năng phân biệt loài, kiểu gen, cũng như các trường hợp nhiễm trùng hỗn hợp mà kính hiển vi và huyết thanh học có thể bỏ sót. Trong ký sinh trùng học, các phương pháp này bao gồm từ PCR thông thường và PCR thời gian thực đến các định dạng khuếch đại đẳng nhiệt được thiết kế để sử dụng tại điểm chăm sóc trong các môi trường có nguồn lực hạn chế.

Definition

Các kỹ thuật chẩn đoán phân tử trong ký sinh trùng học là các phương pháp xét nghiệm trong phòng thí nghiệm nhằm phát hiện và mô tả đặc điểm ký sinh trùng bằng cách khuếch đại và nhận diện các trình tự axit nucleic đặc hiệu của ký sinh trùng, sử dụng PCR và các hóa chất khuếch đại liên quan để xác nhận nhiễm trùng, định kiểu loài và phát hiện các trường hợp nhiễm trùng mật độ thấp hoặc hỗn hợp.

Scope

Chủ đề này bao gồm việc phát hiện dựa trên axit nucleic trong ký sinh trùng học: phản ứng chuỗi polymerase và các biến thể thời gian thực và lồng nhau của nó, các phương pháp đẳng nhiệt như khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng (LAMP), và việc sử dụng các công cụ này để định kiểu loài, phát hiện mật độ thấp, và xác định các trường hợp nhiễm trùng hỗn hợp hoặc ẩn. Nó coi phát hiện phân tử là phương pháp chẩn đoán và không cung cấp các quy trình xét nghiệm hoặc điều trị lâm sàng. Đối với chẩn đoán phân tử trong vi khuẩn học, xem mục liên quan.

Core questions

• Làm thế nào mà khuếch đại axit nucleic đạt được độ nhạy vượt trội so với kính hiển vi và xét nghiệm kháng nguyên?
• Khi nào việc định kiểu loài và kiểu gen thay đổi kết luận chẩn đoán hoặc dịch tễ học?
• Điều gì làm cho các phương pháp đẳng nhiệt như LAMP phù hợp để sử dụng tại điểm chăm sóc và tại hiện trường?
• Việc phát hiện DNA ký sinh trùng nên được diễn giải như thế nào liên quan đến nhiễm trùng hoạt động, có khả năng sống?

Key concepts

• Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
• PCR lồng nhau và thời gian thực (định lượng)
• Khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng (LAMP)
• Định kiểu loài và kiểu gen
• Phát hiện các trường hợp nhiễm trùng hỗn hợp và mật độ thấp
• Độ nhạy và độ đặc hiệu phân tích
• Phát hiện DNA so với khả năng sống của sinh vật

Mechanisms

Các phương pháp này khai thác sự nhận diện đặc hiệu trình tự của DNA ký sinh trùng. Trong PCR, polymerase bền nhiệt và các mồi kẹp một trình tự mục tiêu thúc đẩy quá trình khuếch đại theo cấp số nhân thông qua các chu kỳ biến tính, bắt cặp và kéo dài lặp đi lặp lại, nhờ đó ngay cả một số lượng bản sao ban đầu rất ít cũng có thể được phát hiện; nested PCR bổ sung một cặp mồi thứ hai để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu, và real-time PCR định lượng quá trình khuếch đại khi nó diễn ra. Các phương pháp đẳng nhiệt như LAMP đạt được sự khuếch đại ở một nhiệt độ duy nhất bằng cách sử dụng nhiều mồi và một polymerase dịch chuyển sợi, loại bỏ nhu cầu chu trình nhiệt và cho phép các định dạng đơn giản hơn, có thể triển khai tại hiện trường. Bởi vì sự khuếch đại nhắm vào axit nucleic chứ không phải một sinh vật sống, một kết quả dương tính phải được diễn giải với lưu ý rằng DNA còn sót lại có thể tồn tại sau khi ký sinh trùng không còn sống.

Clinical relevance

Các kỹ thuật phân tử cải thiện việc phát hiện các trường hợp nhiễm trùng mật độ thấp và hỗn hợp, đồng thời cho phép xác định loài và kiểu gen, từ đó hướng dẫn giám sát và mô tả đặc điểm ca bệnh. Mục này mô tả các phương pháp và giới hạn diễn giải của chúng như bằng chứng và không thay thế cho các quy trình phòng thí nghiệm hoặc quyết định lâm sàng.

Epidemiology

Bằng cách phát hiện các trường hợp nhiễm trùng dưới ngưỡng kính hiển vi và phân giải các hỗn hợp loài, các phương pháp phân tử đã điều chỉnh các ước tính về sự mang ký sinh trùng dưới kính hiển vi trong bệnh sốt rét và các bệnh nhiễm trùng khác, cung cấp thông tin cho các mô hình lây truyền và đánh giá chương trình kiểm soát; các định dạng đẳng nhiệt ngày càng được khám phá để xét nghiệm phi tập trung ở các vùng lưu hành, có nguồn lực hạn chế.

History

Việc giới thiệu PCR polymerase bền nhiệt bởi Saiki và các đồng nghiệp vào năm 1988 đã làm cho việc khuếch đại axit nucleic thường quy trở nên khả thi và đã được điều chỉnh cho ký sinh trùng ngay sau đó, với các xét nghiệm nested PCR làm tăng đáng kể độ nhạy phát hiện sốt rét vào đầu những năm 1990. Mô tả về khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng vào năm 2000 đã mở ra một con đường cho chẩn đoán phân tử tại điểm chăm sóc, ít thiết bị, tiếp tục được phát triển cho các bệnh ký sinh trùng.

Debates

Việc phát hiện DNA ký sinh trùng có chứng minh nhiễm trùng đang hoạt động không?

Khuếch đại xác nhận sự hiện diện của axit nucleic ký sinh trùng nhưng bản thân nó không thể xác định rằng một sinh vật sống đang hiện diện, vì DNA còn sót lại có thể tồn tại sau khi đã loại bỏ; điều này làm phức tạp việc sử dụng tính dương tính phân tử như một xét nghiệm chữa khỏi.

Seminal works

• saiki-1988
• notomi-2000
• snounou-1993

Frequently asked questions

Tại sao các xét nghiệm phân tử thường nhạy hơn kính hiển vi?

Khuếch đại có thể nhân lên một vài bản sao DNA ký sinh trùng thành một tín hiệu có thể phát hiện được, do đó các trường hợp nhiễm trùng với mật độ ký sinh trùng rất thấp mà kính hiển vi có thể bỏ sót vẫn có thể được phát hiện và xác định loài.

LAMP mang lại lợi thế gì so với PCR thông thường?

LAMP khuếch đại DNA ở một nhiệt độ không đổi duy nhất mà không cần máy luân nhiệt, làm cho nó đơn giản hơn, nhanh hơn và phù hợp hơn cho các thiết lập tại điểm chăm sóc và tại hiện trường, mặc dù thiết kế và diễn giải xét nghiệm vẫn cần sự cẩn trọng.