PCR và Khuếch đại axit nucleic

Phản ứng chuỗi polymerase — một phương pháp tuần hoàn, định hướng mồi, sao chép một đoạn DNA được chọn theo cấp số nhân — và họ rộng hơn các kỹ thuật khuếch đại được xây dựng dựa trên nó.

Definition

Phản ứng chuỗi polymerase là một phương pháp in vitro khuếch đại một vùng DNA xác định theo cấp số nhân bằng các chu kỳ lặp lại của tách sợi, gắn các mồi bao quanh, và kéo dài bởi một DNA polymerase bền nhiệt; khuếch đại axit nucleic rộng hơn bao gồm các kỹ thuật liên quan để sao chép các trình tự DNA hoặc RNA.

Scope

Chủ đề này bao gồm các nguyên tắc và biến thể của khuếch đại axit nucleic: chu trình nhiệt của biến tính, gắn mồi và kéo dài xác định phản ứng chuỗi polymerase; vai trò của mồi và polymerase bền nhiệt; và các phần mở rộng như phiên mã ngược và khuếch đại định lượng thời gian thực. Nó đề cập đến phương pháp và logic của nó; giải trình tự và nhân bản sử dụng DNA khuếch đại được đề cập trong các chủ đề liên quan.

Core questions

• Làm thế nào các chu kỳ làm nóng và làm nguội lặp lại khuếch đại một vùng DNA cụ thể?
• Tại sao hai mồi và một polymerase bền nhiệt lại cần thiết?
• Làm thế nào quá trình khuếch đại trở thành cấp số nhân?
• Làm thế nào phương pháp này được mở rộng để định lượng axit nucleic hoặc để khuếch đại RNA?

Key theories

Khuếch đại cấp số nhân được xác định bằng mồi

Một cặp mồi bao quanh mục tiêu xác định vùng được khuếch đại, và vì mỗi sợi mới đóng vai trò là khuôn trong chu kỳ tiếp theo, số lượng bản sao mục tiêu tăng gấp đôi mỗi chu kỳ, phát triển theo cấp số nhân.

Polymerase bền nhiệt cho phép thực hiện chu trình

Sử dụng DNA polymerase bền nhiệt cho phép biến tính ở nhiệt độ cao lặp lại mà không cần thêm enzyme, làm cho chu trình nhiệt tự động trở nên khả thi và phản ứng mạnh mẽ.

Mechanisms

Mỗi chu kỳ làm nóng mẫu để tách các sợi DNA, làm nguội để hai mồi gắn vào các trình tự bao quanh mục tiêu trên các sợi đối diện, và làm ấm đến nhiệt độ kéo dài mà tại đó một polymerase bền nhiệt tổng hợp các sợi mới từ các mồi. Bởi vì các sản phẩm của một chu kỳ làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, vùng mục tiêu được khuếch đại theo cấp số nhân qua nhiều chu kỳ. Các biến thể bao gồm khuếch đại phiên mã ngược, đầu tiên sao chép RNA thành DNA, và khuếch đại định lượng thời gian thực, theo dõi sự tích lũy sản phẩm để đo lượng ban đầu.

Clinical relevance

Khuếch đại là trung tâm của xét nghiệm di truyền, phát hiện mầm bệnh và nhận dạng pháp y; được trình bày dưới dạng ý nghĩa hơn là hướng dẫn lâm sàng.

History

Mullis đã hình thành phản ứng chuỗi polymerase vào đầu những năm 1980, và báo cáo năm 1985 của Saiki và các đồng nghiệp đã chứng minh việc sử dụng nó, với việc sau đó áp dụng polymerase bền nhiệt đã làm cho nó trở nên thường quy; phát minh này đã được công nhận bằng Giải Nobel Hóa học năm 1993.

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki1985
• lodish2016

Frequently asked questions

Tại sao PCR cần mồi?

Mồi xác định điểm bắt đầu tổng hợp trên mỗi sợi, vì vậy chúng xác định vùng nào được sao chép và cho phép polymerase bắt đầu kéo dài.

Điều gì làm cho quá trình khuếch đại trở thành cấp số nhân?

Các sợi mới của mỗi chu kỳ trở thành khuôn trong chu kỳ tiếp theo, vì vậy số lượng bản sao của mục tiêu tăng gấp đôi mỗi chu kỳ.