RNA Dizileme Yöntemleri ve Teknolojileri
RNA dizileme (RNA-seq), RNA'yı bir dizileme kütüphanesine dönüştürerek ve ortaya çıkan okumaları genlere ve transkriptlere eşleyerek transkriptomu ölçmektedir. Önceden tanımlanmış problara hibridize etmek yerine transkriptleri doğrudan örnekleyerek, RNA-seq geniş bir dinamik aralıkta gen ifadesini nicelendirebilmekte, daha önce açıklanmamış transkriptleri ve ekleme bölgelerini keşfedebilmekte ve izoform yapısını çözümleyebilmektedir.
Tanım
RNA dizileme, RNA'nın ters transkripsiyonu (veya doğrudan dizilenmesi) ve ortaya çıkan okumaların eşlenmesi ve sayılmasıyla transkript bolluğunu nicelendirmek ve transkriptom genelindeki transkript yapısını karakterize etmek için kullanılan yüksek verimli bir dizileme yaklaşımıdır.
Kapsam
Bu konu, RNA-seq'in deneysel ve hesaplamalı iş akışını kapsamaktadır: RNA seçimi ve kütüphane hazırlığı, kısa okuma ve uzun okuma dizileme kimyaları, okuma hizalaması veya sözde hizalama ve gen ifadesinin nicelenmesi ve normalizasyonu. Transkriptomik içinde metodolojik bir referanstır ve klinik rehberlik sağlamamaktadır.
Temel sorular
- Bir RNA örneği nasıl bir dizileme kütüphanesine dönüştürülür ve hangi seçim adımları (poli-A veya ribozomal tükenme) ölçülenleri şekillendirir?
- Okumalar bir referansa nasıl hizalanır veya sözde hizalanır ve gen veya transkript başına nasıl nicelenir?
- İfade, örnekler arasında karşılaştırılabilecek şekilde normalizasyon nasıl yapılır?
- Uzun okuma ve doğrudan RNA teknolojileri, kısa okuma dizilemeye kıyasla ne gibi katkılar sağlar?
Anahtar kavramlar
- Kütüphane hazırlığı ve poli-A seçimi veya rRNA tükenmesi
- Kısa okuma ve uzun okuma dizileme karşılaştırması
- Okuma hizalaması ve sözde hizalama
- Okuma sayımı ve nicelendirme
- Normalizasyon (örn. FPKM/TPM gibi birimler)
- Dizileme derinliği ve kapsamı
- Ekleme bölgesi tespiti
- Doğrudan RNA dizileme
Mekanizmalar
Tipik bir iş akışında, RNA ekstrakte edilir ve bir alt küme seçilir (genellikle poliadenile haberci RNA veya ribozomal RNA tükenmesinden sonra toplam RNA), parçalanır, tamamlayıcı DNA'ya ters transkripsiyonu yapılır ve adaptör bağlı bir kütüphaneye dönüştürülür. Kütüphane, milyonlarca okuma üretmek için dizilenir; bu okumalar bir referans genoma veya transkriptoma hizalanır ya da hizalama gerektirmeyen sözde hizalama (pseudo-alignment) ile nicelenir. Her bir özelliği çakışan okumalar sayılır; daha uzun transkriptler ve daha derin dizilenmiş örnekler daha fazla okuma biriktirdiğinden, bolluk karşılaştırılmadan önce sayımlar transkript uzunluğu ve kütüphane boyutu için normalize edilir. Mortazavi ve arkadaşları, temel sayım ve normalizasyon çerçevesini tanıtmıştır ve Wang ile Ozsolak'ın derlemeleri platformun güçlü yönlerini ve sınırlamalarını ortaya koymuştur. Uzun okuma ve doğrudan RNA teknolojileri tam uzunlukta molekülleri diziler, okuma başına daha yüksek hata ve daha düşük verim maliyetiyle izoform çözünürlüğünü iyileştirmektedir.
Klinik önem
RNA-seq, araştırma ve translasyonel genomikte moleküler sınıflandırma ve biyobelirteç keşfi kanıtlarının çoğunu üretmekte ve giderek artan bir şekilde tanısal transkript ve füzyon tespitini desteklemektedir. Bir referans konu olarak, transkriptomik kanıtın nasıl üretildiğini açıklamaktadır; bireysel tanı veya tedavi kararları için bir temel değildir.
Kanıt ve kılavuzlar
RNA-seq için en iyi uygulama çerçeveleri, Mortazavi ve arkadaşlarının temel nicelendirme çalışmalarından ve yöntem derlemelerinden (Wang ve arkadaşları; Ozsolak ve Milos) türetilmiştir. Uzun okuma analizi, Amarasinghe ve arkadaşları tarafından incelenen kendi değerlendirmelerini eklemektedir. Bunlar, klinik uygulama kılavuzlarından ziyade metodolojik referanslardır.
Tarihçe
RNA-seq, 2008 yılında yüksek verimli kısa okuma dizilemenin ters transkripsiyonu yapılmış RNA'ya uygulanmasıyla ortaya çıkmıştır. Mortazavi ve arkadaşları, memeli transkriptomlarının okuma sayılarından nasıl eşleneceğini ve nicelendirileceğini belirlemiştir. Sonraki yıllardaki derlemeler, kütüphane hazırlığı ve analiz standartlarını pekiştirmiş ve 2010'ların ortalarından itibaren uzun okuma ve doğrudan RNA platformları, yaklaşımı tam uzunlukta izoform dizilemeye doğru genişletmiştir.
Tartışmalar
- Kısa okuma ve uzun okuma dizileme karşılaştırması
- Kısa okumalar yüksek verim ve düşük baz başına hata sunar ancak izoformları yalnızca dolaylı olarak yeniden yapılandırır; oysa uzun okumalar tam uzunlukta transkriptleri diziler ve izoformları doğrudan çözer, ancak bu durum daha yüksek hata oranları ve daha düşük derinlik maliyetiyle gerçekleşir. Uygun seçim, doğru nicelendirme mi yoksa izoform yapısı mı öncelikli olduğuna bağlıdır.
Öne çıkan isimler
- Barbara Wold
- Ali Mortazavi
- Michael Snyder
İlgili konular
Temel eserler
- mortazavi-2008
- wang-2009
- ozsolak-2011
Sıkça sorulan sorular
- Poli-A seçimi ile ribozomal RNA tükenmesi arasındaki fark nedir?
- Poli-A seçimi, poliadenile haberci RNA'yı yakalar ve protein kodlayan transkriptler için etkilidir; oysa ribozomal RNA tükenmesi, bol miktardaki rRNA'yı uzaklaştırırken poliadenile olmayan ve bozulmuş transkriptleri korur. Bu seçim, deneyin hangi RNA türlerini ölçebileceğini belirler.
- RNA-seq sayımları karşılaştırmadan önce neden normalize edilir?
- Ham okuma sayıları, transkript uzunluğuna ve her bir örneğin ne kadar derin dizilendiğine bağlıdır, bu nedenle doğrudan karşılaştırılamazlar. Normalizasyon bu faktörleri ayarlar, böylece bolluktaki farklılıklar teknik derinlik veya uzunluktan ziyade biyolojiyi yansıtır.
Bu kavram için yöntemler
- RNA-seq Differential Expression
- Single-cell RNA-seq analysis
- De Novo Transcriptome Assembly
- Bayesian RNA-seq differential expression
- Time-series single-cell RNA-seq analysis
- Differential single-cell RNA-seq analysis
- Single-cell RNA-seq differential expression
- Machine learning-assisted RNA-seq differential expression