จุลทรรศน์แบบใช้แสงและการขยาย

จุลทรรศน์แบบใช้แสงใช้แสงที่มองเห็นได้และระบบเลนส์เพื่อสร้างภาพขยายของชิ้นงาน และเป็นวิธีการที่เก่าแก่ที่สุดและใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดในการตรวจสอบเซลล์และเนื้อเยื่อ การขยายจะทำให้ภาพใหญ่ขึ้น แต่รายละเอียดที่เป็นประโยชน์ถูกกำหนดโดยความละเอียด ซึ่งธรรมชาติของคลื่นแสงจำกัดไว้ที่ขนาดประมาณความยาวคลื่นของแสงที่ใช้

Definition

จุลทรรศน์แบบใช้แสงคือจุลทรรศน์ที่ใช้แสงที่มองเห็นได้ซึ่งส่องผ่านหรือสะท้อนจากชิ้นงานถูกโฟกัสโดยเลนส์เพื่อสร้างภาพขยาย; การขยายคือปัจจัยที่ภาพถูกขยายให้ใหญ่ขึ้น ในขณะที่ความละเอียดคือการแยกที่เล็กที่สุดที่จุดสองจุดยังคงแยกแยะได้

Scope

บทความนี้ครอบคลุมถึงวิธีการที่กล้องจุลทรรศน์แบบประกอบสร้างภาพขยาย ความแตกต่างระหว่างการขยายและความละเอียด ขีดจำกัดการเลี้ยวเบนที่จำกัดกำลังการแยก และโหมดความคมชัดทั่วไปสำหรับการดูเซลล์ที่โปร่งใสเป็นส่วนใหญ่ โดยถือว่าจุลทรรศน์แบบใช้แสงเป็นวิธีการสร้างภาพพื้นฐาน ไม่ใช่คำแนะนำทางคลินิก

Core questions

• ความแตกต่างระหว่างการขยายและความละเอียดคืออะไร?
• เหตุใดความยาวคลื่นของแสงจึงกำหนดขีดจำกัดของกำลังการแยก?
• จะสร้างความคมชัดจากเซลล์สิ่งมีชีวิตที่เกือบโปร่งใสได้อย่างไร?
• เมื่อใดที่การเพิ่มการขยายจะหยุดเพิ่มรายละเอียดที่เป็นประโยชน์?

Key concepts

• การขยาย
• ความละเอียดและขีดจำกัดการเลี้ยวเบน
• รูรับแสงเชิงตัวเลข
• ไบรท์ฟิลด์ (Bright-field), เฟสคอนทราสต์ (phase-contrast) และดิฟเฟอเรนเชียลอินเตอร์เฟียเรนซ์คอนทราสต์ (differential interference contrast)
• การขยายที่ว่างเปล่า
• การย้อมสีเพื่อสร้างความคมชัด

Mechanisms

กล้องจุลทรรศน์แบบประกอบใช้เลนส์วัตถุและเลนส์ใกล้ตาเพื่อขยายภาพของชิ้นงาน แต่รายละเอียดที่สามารถแยกแยะได้ขึ้นอยู่กับการเลี้ยวเบน: ตามที่กำหนดไว้ในทฤษฎีการสร้างภาพของ Abbe ในศตวรรษที่สิบเก้า กำลังการแยกจะดีขึ้นเมื่อความยาวคลื่นสั้นลงและรูรับแสงเชิงตัวเลข (numerical aperture) ใหญ่ขึ้น ดังนั้นกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่มองเห็นได้จึงไม่สามารถแยกแยะคุณสมบัติที่เล็กกว่าไม่กี่ร้อยนาโนเมตรได้มากนัก การขยายเกินกว่าที่ความละเอียดรองรับจะทำให้เกิดการขยายที่ว่างเปล่า (empty magnification) — ภาพที่ใหญ่ขึ้นแต่ไม่มีรายละเอียดเพิ่มเติม เนื่องจากเซลล์ส่วนใหญ่โปร่งใส ความคมชัดจึงถูกสร้างขึ้นโดยการย้อมสีหรือโดยวิธีการทางแสง เช่น เฟสคอนทราสต์ (phase-contrast) และดิฟเฟอเรนเชียลอินเตอร์เฟียเรนซ์คอนทราสต์ (differential interference contrast) ที่แปลงความแตกต่างของดัชนีหักเหให้เป็นความแตกต่างของความเข้มที่มองเห็นได้

Clinical relevance

จุลทรรศน์แบบใช้แสงมีความสำคัญต่อจุลพยาธิวิทยา (histology), เซลล์วิทยา (cytology), โลหิตวิทยา (haematology) และจุลชีววิทยา (microbiology) ซึ่งมีการตรวจสอบชิ้นงานที่ย้อมสีเพื่อหาลักษณะทางวินิจฉัย บทความนี้อธิบายหลักการทางแสงที่อยู่เบื้องหลังภาพดังกล่าว และมีวัตถุประสงค์เพื่อการศึกษาอ้างอิง ไม่ใช่พื้นฐานสำหรับการวินิจฉัยหรือการตัดสินใจในการรักษาเฉพาะบุคคล

History

กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงแบบประกอบได้เปิดเผยเซลล์ตั้งแต่ศตวรรษที่สิบเจ็ดเป็นต้นมา แต่ความเข้าใจเชิงปริมาณเกี่ยวกับข้อจำกัดของมันมาพร้อมกับทฤษฎีการเลี้ยวเบนของ Abbe ในปี 1873 ซึ่งเชื่อมโยงกำลังการแยกเข้ากับความยาวคลื่นและรูรับแสงเชิงตัวเลข และอธิบายว่าทำไมจุลทรรศน์เชิงแสงจึงไม่สามารถแยกแยะรายละเอียดที่เล็กมากได้ตามอำเภอใจ อุปสรรคการเลี้ยวเบนนั้นได้กำหนดกรอบของจุลทรรศน์มานานกว่าหนึ่งศตวรรษ และกระตุ้นให้เกิดทั้งจุลทรรศน์อิเล็กตรอน และต่อมา วิธีการเรืองแสงแบบความละเอียดสูงพิเศษ (super-resolution fluorescence methods)

Key figures

• Ernst Abbe
• Douglas Murphy

Seminal works

• abbe-1873
• murphy-2012

Frequently asked questions

การขยายที่สูงขึ้นดีกว่าเสมอไปหรือไม่?

ไม่ การขยายเพียงแค่ทำให้ภาพใหญ่ขึ้นเท่านั้น หากเกินขีดจำกัดที่กำหนดโดยความละเอียด จะทำให้เกิดการขยายที่ว่างเปล่า ซึ่งเป็นภาพที่ใหญ่ขึ้นแต่ไม่มีรายละเอียดเพิ่มเติม

เหตุใดกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงจึงไม่สามารถแยกแยะโครงสร้างที่เล็กมากได้?

เนื่องจากการเลี้ยวเบน กำลังการแยกของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงถูกจำกัดด้วยความยาวคลื่นของแสงที่มองเห็นได้และรูรับแสงเชิงตัวเลขของเลนส์วัตถุ ซึ่งจำกัดรายละเอียดไว้ที่ประมาณไม่กี่ร้อยนาโนเมตร