การตรึงและการฝังเนื้อเยื่อ
การตรึงและการฝังเป็นขั้นตอนแรกในการเตรียมเนื้อเยื่อทางจุลพยาธิวิทยา การตรึงจะทำให้เนื้อเยื่อคงตัวทางเคมีเพื่อหยุดการเสื่อมสลายและรักษาสภาพโครงสร้างไว้ ในขณะที่การฝังจะห่อหุ้มเนื้อเยื่อที่ตรึงไว้ด้วยตัวกลางที่แข็งแรงเพื่อรองรับการตัดเป็นชิ้นบางๆ ทั้งสองกระบวนการนี้ร่วมกันเป็นตัวกำหนดว่าสไลด์สุดท้ายจะสะท้อนเนื้อเยื่อที่มีชีวิตได้อย่างแม่นยำเพียงใด
Definition
การตรึงเนื้อเยื่อคือการบำบัดทางเคมีหรือทางกายภาพที่ยับยั้งการสลายตัวของเซลล์และเนื้อเยื่อ (autolysis) และการเน่าเปื่อย (putrefaction) รวมถึงทำให้โครงสร้างเนื้อเยื่อคงตัว การฝังคือการแทรกซึมเนื้อเยื่อที่ตรึงและผ่านกระบวนการแล้วด้วยตัวกลางรองรับ (เช่น พาราฟินหรือเรซิน) เพื่อให้สามารถตัดเป็นชิ้นบางๆ ได้
Scope
หัวข้อนี้ครอบคลุมวัตถุประสงค์และเคมีหลักของการตรึง ขั้นตอนการเตรียมเนื้อเยื่อ (การกำจัดน้ำ การทำให้ใส การแทรกซึม) และการฝังในพาราฟินหรือเรซิน เป็นข้อมูลอ้างอิงทางระเบียบวิธีวิจัยและไม่ได้ให้แนวทางการให้ยาทางคลินิกหรือในห้องปฏิบัติการ
Core questions
- สารตรึงหยุดการเสื่อมสภาพของเนื้อเยื่อพร้อมทั้งรักษาสภาพโครงสร้างได้อย่างไร?
- สารตรึงแบบเชื่อมขวางและสารตรึงแบบตกตะกอนแตกต่างกันอย่างไรในด้านผลกระทบ?
- เหตุใดเนื้อเยื่อจึงต้องผ่านการกำจัดน้ำ การทำให้ใส และการแทรกซึมก่อนการฝัง?
- ตัวกลางฝังมีข้อจำกัดต่อความหนาของชิ้นเนื้อและการวิเคราะห์ขั้นปลายอย่างไร?
Key concepts
- การสลายตัวของเซลล์และเนื้อเยื่อ (Autolysis) และการยับยั้ง
- สารตรึงแบบเชื่อมขวาง (แอลดีไฮด์)
- สารตรึงแบบตกตะกอน (แอลกอฮอล์)
- การตรึงด้วยฟอร์มาลิน
- การกำจัดน้ำและการทำให้ใส
- การฝังพาราฟิน
- การฝังเรซิน
Mechanisms
สารตรึงทำงานโดยกลไกหลักสองประการ สารตรึงแบบเชื่อมขวาง (cross-linking fixatives) เช่น ฟอร์มาลดีไฮด์และกลูตาราลดีไฮด์ จะสร้างสะพานเมทิลีนหรือสะพานที่ยาวกว่าระหว่างหมู่ที่ทำปฏิกิริยา (ส่วนใหญ่เป็นโปรตีน) เพื่อยึดโครงสร้างโมเลกุลให้อยู่กับที่ โดยกลูตาราลดีไฮด์ซึ่งมีหมู่แอลดีไฮด์สองหมู่ จะเชื่อมขวางได้กว้างขวางกว่าและรักษารายละเอียดโครงสร้างระดับจุลภาค (fine ultrastructure) ได้ดีเป็นพิเศษ ซึ่งเป็นเหตุผลที่ทำให้กลายเป็นสารสำคัญในการตรึงเพื่อการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (Sabatini, 1963) ในทางกลับกัน สารตรึงแบบตกตะกอน (coagulant fixatives) เช่น เอทานอล จะทำงานโดยการกำจัดน้ำและทำให้โปรตีนตกตะกอน เนื่องจากการเชื่อมขวางอาจบดบังแอนติเจน จึงมีการออกแบบสารตรึงเพื่อให้เกิดความสมดุลระหว่างการรักษาสภาพโครงสร้างกับการคงไว้ซึ่งปฏิกิริยา เช่น สูตร periodate-lysine-paraformaldehyde ที่พัฒนาขึ้นสำหรับการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนเชิงภูมิคุ้มกัน (immunoelectron microscopy) (McLean & Nakane, 1974) หลังจากการตรึง เนื้อเยื่อจะถูกกำจัดน้ำผ่านแอลกอฮอล์ที่มีความเข้มข้นไล่ระดับ ทำให้ใสในตัวทำละลายที่เข้ากันได้กับตัวกลางฝัง และแทรกซึมด้วยพาราฟินหลอมเหลวหรือเรซินเหลว ซึ่งเมื่อแข็งตัวจะให้การรองรับทางกลที่จำเป็นสำหรับการตัดด้วยไมโครโทม
Clinical relevance
การตรึงและการฝังเป็นตัวกำหนดคุณภาพและการคงสภาพโมเลกุลของบล็อกเนื้อเยื่อที่ใช้ในการวินิจฉัยทางพยาธิวิทยาและการวิจัย รายการนี้อธิบายวิธีการในเชิงแนวคิด โดยอธิบายถึงวิธีการเตรียมชิ้นงานและไม่ใช่พื้นฐานสำหรับการตัดสินใจวินิจฉัยหรือการรักษาเฉพาะบุคคล
Evidence & guidelines
แนวปฏิบัติในการตรึงและการเตรียมเนื้อเยื่อได้ถูกรวบรวมไว้ในเอกสารอ้างอิงมาตรฐานทางจุลพยาธิวิทยา เช่น Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques (Suvarna et al., 2018) และ Kiernan (2015) ตัวแปรการตรึงก่อนการวิเคราะห์ (ชนิดของสารตรึง ระยะเวลาในการตรึง ระยะเวลาการตรึง) ได้รับการยอมรับว่ามีอิทธิพลต่อการทดสอบโมเลกุลขั้นปลาย และมีการกล่าวถึงในเอกสารคุณภาพของห้องปฏิบัติการในหัวข้อที่เกี่ยวข้องกับอิมมูโนฮิสโตเคมีและการประเมินคุณภาพ
History
เคมีของการตรึงที่ใช้ได้จริงพัฒนาขึ้นตลอดศตวรรษที่สิบเก้า โดยมีการนำฟอร์มาลินมาใช้เป็นสารตรึงเนื้อเยื่อในช่วงปลายทศวรรษ 1890 และการฝังพาราฟินได้ถูกกำหนดให้เป็นวิธีในการตัดชิ้นเนื้อบางๆ ในศตวรรษที่ยี่สิบ การตรึงด้วยกลูตาราลดีไฮด์ได้รับการศึกษาเพื่อการรักษาสภาพโครงสร้างระดับจุลภาค (Sabatini, 1963) และมีการคิดค้นสารตรึงเฉพาะทางเพื่อรักษาแอนติเจนควบคู่ไปกับโครงสร้าง (McLean & Nakane, 1974)
Key figures
- David Sabatini
- Paul Nakane
Related topics
Seminal works
- sabatini-1963
- mclean-1974
Frequently asked questions
- เหตุใดฟอร์มาลินจึงเป็นสารตรึงที่ใช้บ่อยที่สุดสำหรับการตรวจทางจุลพยาธิวิทยาตามปกติ?
- ฟอร์มาลดีไฮด์บัฟเฟอร์สามารถแทรกซึมเนื้อเยื่อได้ค่อนข้างดี เชื่อมขวางโปรตีนเพื่อรักษาสภาพโครงสร้างโดยรวม มีราคาไม่แพง และเข้ากันได้กับการย้อมสีตามปกติและการทดสอบขั้นปลายส่วนใหญ่ ซึ่งทำให้เป็นสารตรึงมาตรฐานอเนกประสงค์
- เหตุใดเนื้อเยื่อจึงต้องผ่านการกำจัดน้ำและทำให้ใสก่อนการฝังพาราฟิน?
- พาราฟินไม่สามารถเข้ากันได้กับน้ำ ดังนั้นน้ำในเนื้อเยื่อจึงถูกแทนที่ด้วยแอลกอฮอล์ที่มีความเข้มข้นไล่ระดับ (การกำจัดน้ำ) จากนั้นจึงแทนที่ด้วยตัวทำละลายที่เข้ากันได้กับพาราฟิน (การทำให้ใส) ก่อนที่พาราฟินหลอมเหลวจะสามารถแทรกซึมและรองรับเนื้อเยื่อได้