เทคนิคจุลทรรศน์และอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์

จุลทรรศน์และอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ตรวจจับไวรัสโดยการแสดงภาพอนุภาคไวรัสเอง หรือแอนติเจนของไวรัสภายในเซลล์ที่ติดเชื้อ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนสามารถแยกแยะสัณฐานวิทยาของอนุภาคไวรัสได้โดยตรง ในขณะที่อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ใช้แอนติบอดีติดฉลากเรืองแสงเพื่อส่องสว่างโปรตีนไวรัสจำเพาะภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนส์ ซึ่งเป็นการรวมความจำเพาะของการจับของแอนติบอดีเข้ากับรายละเอียดเชิงพื้นที่ของจุลทรรศน์

Definition

เทคนิคจุลทรรศน์และอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์เป็นวิธีการตรวจจับที่อาศัยการแสดงภาพ ซึ่งอาจถ่ายภาพอนุภาคไวรัสโดยตรง (กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน) หรือเปิดเผยแอนติเจนของไวรัสในเซลล์โดยใช้แอนติบอดีติดฉลากเรืองแสง (อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์)

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมวิธีการแอนติบอดีเรืองแสง (อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์โดยตรงและโดยอ้อม) สำหรับการตรวจหาแอนติเจนของไวรัสในเซลล์และเนื้อเยื่อ และแนวทางกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน เช่น การย้อมสีเชิงลบสำหรับการแสดงภาพอนุภาคไวรัส โดยจะอธิบายหลักการและการใช้งานในระดับอ้างอิง และไม่ได้ให้ระเบียบวิธีปฏิบัติหรือคำแนะนำการจัดการทางคลินิก

Core questions

• เมื่อใดที่การแสดงภาพอนุภาคไวรัสหรือแอนติเจนให้ข้อมูลมากกว่าการตรวจหายีนของมัน?
• อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์โดยตรงและโดยอ้อมแตกต่างกันอย่างไรในการส่งมอบฉลาก?
• สัณฐานวิทยาของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนสามารถเปิดเผยอะไรได้บ้างเมื่อไม่ทราบชนิดของไวรัส?
• ความจำเพาะของการจับของแอนติบอดีและคุณภาพของตัวอย่างส่งผลต่อการตีความอย่างไร?

Key concepts

• การทดสอบแอนติบอดีเรืองแสงโดยตรง (DFA)
• การตรวจอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์โดยอ้อม (IFA)
• แอนติบอดีติดฉลากฟลูออโรฟอร์
• กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน
• การย้อมสีเชิงลบ
• อิมมูโนอิเล็กตรอนไมโครสโคปี
• ร่างรวมของไวรัส
• การระบุชนิดตามสัณฐานวิทยา

Mechanisms

อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ใช้ประโยชน์จากแอนติบอดีที่ติดฉลากด้วยสีย้อมเรืองแสง ในวิธีโดยตรง แอนติบอดีที่ติดฉลากจะจับกับแอนติเจนของไวรัสในเซลล์ที่ตรึงไว้และปรากฏเป็นฟลูออเรสเซนส์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ในวิธีโดยอ้อม แอนติบอดีปฐมภูมิที่ไม่ได้ติดฉลากจะจับกับแอนติเจน และแอนติบอดีทุติยภูมิที่ติดฉลากจะจับกับแอนติบอดีปฐมภูมิ ซึ่งเป็นการขยายสัญญาณ รูปแบบและตำแหน่งของฟลูออเรสเซนส์บ่งชี้ว่ามีแอนติเจนของไวรัสชนิดใดและอยู่ที่ใด กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนจะถ่ายภาพโครงสร้างโดยตรงแทน: การย้อมสีเชิงลบจะล้อมรอบอนุภาคไวรัสด้วยสีย้อมที่หนาแน่นด้วยอิเล็กตรอน เพื่อให้รูปร่างและขนาดของพวกมันโดดเด่น ทำให้สามารถจดจำตระกูลไวรัสทางสัณฐานวิทยาได้ อิมมูโนอิเล็กตรอนไมโครสโคปี (Immunoelectron microscopy) เพิ่มความจำเพาะที่อาศัยแอนติบอดีในการแสดงภาพนี้ เนื่องจากวิธีการเหล่านี้ให้รายละเอียดเชิงพื้นที่ คุณภาพการเตรียมตัวอย่างและความจำเพาะของแอนติบอดีจึงมีอิทธิพลอย่างมากต่อข้อสรุปที่สามารถทำได้

Clinical relevance

อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ให้การตรวจจับและการระบุตำแหน่งที่อาศัยแอนติเจนอย่างรวดเร็วในเซลล์และเนื้อเยื่อ และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนนำเสนอวิธีที่ครอบคลุมในการจดจำอนุภาคไวรัสด้วยรูปร่าง ซึ่งมีความสำคัญในอดีตสำหรับการระบุเชื้อก่อโรคชนิดใหม่หรือที่ไม่คาดคิด บทความนี้อธิบายสิ่งที่วิธีการแสดงภาพเหล่านี้แสดงให้เห็นและการพึ่งพาคุณภาพของตัวอย่าง; เป็นการอธิบายระเบียบวิธีวิจัยและไม่ใช่พื้นฐานสำหรับการวินิจฉัยหรือการตัดสินใจในการรักษาเฉพาะบุคคล

History

อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ได้รับการพัฒนาโดย Albert Coons และเพื่อนร่วมงาน ซึ่งการปรับปรุงในปี 1950 ทำให้การระบุตำแหน่งแอนติเจนด้วยแอนติบอดีเรืองแสงเป็นไปได้ในทางปฏิบัติ และเป็นรากฐานของชุดการทดสอบวินิจฉัยที่หลากหลาย กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบย้อมสีเชิงลบ ซึ่งนำเสนอโดย Brenner และ Horne ในปี 1959 ได้ให้นักไวรัสวิทยาเป็นวิธีที่รวดเร็วในการแสดงภาพสัณฐานวิทยาของอนุภาคไวรัส และมีส่วนช่วยในการค้นพบและการจดจำไวรัสจำนวนมากก่อนที่การระบุด้วยวิธีโมเลกุลจะกลายเป็นเรื่องปกติ

Key figures

• Albert Coons
• Sydney Brenner
• Robert Horne

Seminal works

• coons-kaplan-1950
• brenner-horne-1959

Frequently asked questions

ความแตกต่างระหว่างอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์โดยตรงและโดยอ้อมคืออะไร?

ในอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์โดยตรง แอนติบอดีที่ติดฉลากเรืองแสงเพียงตัวเดียวจะจับกับแอนติเจนของไวรัส ในขณะที่อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์โดยอ้อมใช้แอนติบอดีปฐมภูมิที่ไม่ได้ติดฉลากตามด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ติดฉลาก ซึ่งจะขยายสัญญาณและเพิ่มความยืดหยุ่นโดยมีค่าใช้จ่ายเพิ่มขึ้นอีกหนึ่งขั้นตอน

เหตุใดกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนจึงยังคงมีประโยชน์แม้จะมีวิธีการทางโมเลกุล?

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนสามารถจดจำอนุภาคไวรัสด้วยรูปร่างที่เป็นลักษณะเฉพาะโดยไม่จำเป็นต้องทราบล่วงหน้าว่าจะมองหาไวรัสชนิดใด ทำให้มีคุณค่าสำหรับการตรวจสอบเชื้อก่อโรคชนิดใหม่หรือที่ไม่คาดคิดที่การทดสอบทางโมเลกุลแบบเฉพาะเจาะจงอาจพลาดไปได้