Иммуногистохимия и методы детекции белков

Иммуногистохимия (ИГХ) локализует и измеряет белки в срезах тканей с использованием антител, связанных с видимой меткой, показывая, где экспрессируется генный продукт и, полуколичественно, в каком количестве. Являясь белковым аналогом количественной оценки транскриптов, она является рутинным инструментом в диагностической и молекулярной патологии.

Definition

Иммуногистохимия — это метод, основанный на анализе тканей, который использует меченые антитела для обнаружения специфических белков in situ, визуализируя их клеточную и субклеточную локализацию и предоставляя полуколичественную оценку экспрессии белка.

Scope

Эта тема охватывает принцип детекции на основе антител, разницу между качественной локализацией и полуколичественной оценкой интенсивности и распространенности окрашивания, важность стандартизации и контроля, а также известные применения, такие как оценка гормональных рецепторов и HER2, в качестве иллюстраций метода. Она рассматривает ИГХ как методологию измерения и не предоставляет диагностических порогов или указаний по лечению.

Core questions

• Как меченые антитела локализуют белок в срезе ткани?
• Как окрашивание преобразуется в полуколичественный балл?
• Почему контроль и стандартизация необходимы для воспроизводимой ИГХ?
• Как детекция на уровне белка дополняет количественную оценку транскриптов?

Key concepts

• Связывание антитело-антиген
• Демаскировка антигена
• Хромогенная и флуоресцентная детекция
• Полуколичественная оценка (интенсивность и распространенность)
• Положительный и отрицательный контроль
• Эффекты преаналитической фиксации

Mechanisms

Первичное антитело связывается со своей целевой антигеном в фиксированном срезе ткани; детекция усиливается с помощью вторичных антител и систем, связанных с ферментами или флуорофорами, которые образуют окрашенный или флуоресцентный осадок в месте расположения антигена. Этапы фиксации и демаскировки антигена влияют на то, остаются ли эпитопы обнаруживаемыми, поэтому преаналитическая обработка сильно влияет на результат. Экспрессия считывается полуколичественно путем оценки интенсивности окрашивания и доли положительных клеток, часто объединяемых в балл; поскольку это считывание зависит от наблюдателя и протокола, для воспроизводимости необходимы валидированные контроли и стандартизированные процедуры. Профессиональные рекомендации иллюстрируют, как стандартизируются оценка и преаналитические переменные для тестирования рецепторов (Hammond et al., 2010; Wolff et al., 2013).

Clinical relevance

ИГХ занимает центральное место в диагностике тканей и в отчетности по белковым биомаркерам, и понимание ее полуколичественной природы является частью интерпретации патологических заключений. Эта статья описывает метод и его стандартизацию; цитируемые рекомендации приводятся для иллюстрации методологии и отчетности, а не для предоставления диагностических порогов или решений о лечении для отдельных пациентов.

Evidence & guidelines

Стандартизация полуколичественной ИГХ иллюстрируется совместными рекомендациями ASCO/CAP по тестированию рецепторов эстрогена и прогестерона (Hammond et al., 2010) и по тестированию HER2 при раке молочной железы (Wolff et al., 2013), которые определяют требования к преаналитической обработке, оценке и контролю. Они цитируются здесь в качестве методологических ссылок.

History

Окрашивание тканей на основе антител развилось из иммунофлуоресценции в середине двадцатого века, за которым последовали фермент-связанные иммунопероксидазные методы, которые позволили получить постоянное, видимое в световом микроскопе окрашивание. По мере того как белковые биомаркеры стали центральными в патологии, внимание сместилось к стандартизации фиксации, демаскировки антигена и оценки, что было формализовано в консенсусных рекомендациях по тестированию рецепторов (Hammond et al., 2010; Wolff et al., 2013).

Debates

Насколько воспроизводима полуколичественная оценка ИГХ?

Поскольку интенсивность и распространенность окрашивания оцениваются визуально и зависят от фиксации и протокола, результаты могут варьироваться между наблюдателями и лабораториями; для повышения воспроизводимости используются стандартизированные преаналитические процедуры, валидированные контроли и определенные критерии оценки.

Key figures

• M. Elizabeth Hammond
• Antonio Wolff
• D. Craig Allred

Seminal works

• hammond-2010
• wolff-2013

Frequently asked questions

Является ли иммуногистохимия количественной?

ИГХ лучше всего описывать как полуколичественную: она оценивает экспрессию белка путем оценки интенсивности окрашивания и доли положительных клеток, а не путем получения точной концентрации, поэтому стандартизированная оценка и контроль важны.

Почему фиксация тканей влияет на результаты ИГХ?

Фиксация и последующий этап демаскировки антигена могут маскировать или обнажать эпитопы, с которыми связываются антитела, поэтому вариации в преаналитической обработке могут изменять окрашивание и должны быть стандартизированы для получения надежных результатов.