Методы микроскопии и иммунофлуоресценции

Микроскопия и иммунофлуоресценция позволяют обнаруживать вирусы путем визуализации либо самих вирусных частиц, либо вирусных антигенов внутри инфицированных клеток. Электронная микроскопия непосредственно выявляет морфологию вирусных частиц, в то время как иммунофлуоресценция использует меченые флуоресцентными красителями антитела для выявления специфических вирусных белков под флуоресцентным микроскопом, сочетая специфичность связывания антител с пространственной детализацией микроскопии.

Definition

Методы микроскопии и иммунофлуоресценции — это методы обнаружения, основанные на визуализации, которые либо непосредственно отображают вирусные частицы (электронная микроскопия), либо выявляют вирусные антигены в клетках с использованием флуоресцентно меченых антител (иммунофлуоресценция).

Scope

Эта тема охватывает методы флуоресцирующих антител (прямая и непрямая иммунофлуоресценция) для обнаружения вирусных антигенов в клетках и тканях, а также подходы электронной микроскопии, такие как негативное контрастирование для визуализации вирусных частиц. В ней объясняются принципы и области применения на справочном уровне, без предоставления протоколов или рекомендаций по клиническому ведению.

Core questions

• Когда визуализация вирусной частицы или антигена более информативна, чем обнаружение ее генома?
• Чем прямая и непрямая иммунофлуоресценция отличаются по способу доставки метки?
• Что может выявить морфология при электронной микроскопии, когда идентичность вируса неизвестна?
• Как специфичность связывания антител и качество образца влияют на интерпретацию?

Key concepts

• Прямой флуоресцентный антительный тест (ПФАТ)
• Непрямой иммунофлуоресцентный анализ (НИФА)
• Антитело, меченное флуорофором
• Электронная микроскопия
• Негативное контрастирование
• Иммуноэлектронная микроскопия
• Вирусные включения
• Идентификация на основе морфологии

Mechanisms

Иммунофлуоресценция использует антитела, меченные флуоресцентным красителем. При прямом методе меченое антитело связывается с вирусным антигеном в фиксированных клетках и наблюдается как флуоресценция под микроскопом; при непрямом методе немеченое первичное антитело связывается с антигеном, а затем меченое вторичное антитело связывается с первичным, усиливая сигнал. Характер и локализация флуоресценции указывают на присутствие и расположение вирусных антигенов. Электронная микроскопия, напротив, непосредственно отображает структуру: негативное контрастирование окружает вирусные частицы электронно-плотным красителем, так что их форма и размер выделяются, что позволяет морфологически распознавать семейства вирусов. Иммуноэлектронная микроскопия добавляет специфичность, основанную на антителах, к этой визуализации. Поскольку эти методы считывают пространственные детали, качество подготовки образца и специфичность антител сильно влияют на то, какие выводы могут быть сделаны.

Clinical relevance

Иммунофлуоресценция обеспечивает быстрое обнаружение и локализацию антигенов в клетках и тканях, а электронная микроскопия предлагает универсальный способ распознавания вирусных частиц по форме, что исторически важно для идентификации новых или неожиданных агентов. Эта статья описывает, что показывают эти методы визуализации и их зависимость от качества образца; она носит описательный характер методологии и не является основой для индивидуальных диагностических или лечебных решений.

History

Иммунофлуоресценция была разработана Альбертом Кунсом и его коллегами, чье усовершенствование в 1950 году сделало флуоресцентно-антительное определение антигенов практичным и положило начало широкому семейству диагностических анализов. Электронная микроскопия с негативным контрастированием, введенная Бреннером и Хорном в 1959 году, предоставила вирусологам быстрый способ визуализации морфологии вирусных частиц и способствовала открытию и распознаванию многих вирусов до того, как молекулярная идентификация стала рутинной.

Key figures

• Albert Coons
• Sydney Brenner
• Robert Horne

Seminal works

• coons-kaplan-1950
• brenner-horne-1959

Frequently asked questions

В чем разница между прямой и непрямой иммунофлуоресценцией?

При прямой иммунофлуоресценции одно флуоресцентно меченое антитело связывается с вирусным антигеном, тогда как непрямая иммунофлуоресценция использует немеченое первичное антитело, за которым следует меченое вторичное антитело, что усиливает сигнал и добавляет гибкости ценой дополнительного этапа.

Почему электронная микроскопия остается полезной, несмотря на молекулярные методы?

Электронная микроскопия может распознавать вирусные частицы по их характерной форме, не зная заранее, какой вирус искать, что делает ее ценной для исследования новых или неожиданных агентов, которые могут быть пропущены целевыми молекулярными анализами.