PCR dan Teknik Amplifikasi Asam Nukleat

Teknik amplifikasi asam nukleat menyalin sekuens DNA atau RNA pilihan berkali-kali sehingga target yang ada dalam jumlah sangat kecil menjadi terdeteksi dan terukur. Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah arketipe: melalui siklus denaturasi, penempelan primer, dan ekstensi polimerase yang berulang, PCR menghasilkan peningkatan eksponensial dalam sekuens tertentu, menjadikannya landasan diagnostik molekuler.

Definition

Teknik amplifikasi asam nukleat adalah metode in vitro yang secara enzimatik menghasilkan banyak salinan sekuens DNA atau RNA spesifik, dengan PCR menggunakan siklus termal dan DNA polimerase untuk mengamplifikasi wilayah yang ditentukan oleh dua primer.

Scope

Topik ini mencakup PCR titik akhir konvensional, PCR waktu nyata (kuantitatif), PCR transkripsi balik untuk target RNA, dan alternatif isotermal seperti amplifikasi isotermal yang dimediasi loop. Topik ini membahas prinsip, komponen, dan pertimbangan pelaporan amplifikasi sebagai referensi metodologis, bukan sebagai protokol pengujian atau panduan klinis.

Key concepts

• Siklus termal (denaturasi, penempelan, ekstensi)
• Primer dan DNA polimerase
• Amplifikasi eksponensial
• PCR transkripsi balik untuk target RNA
• PCR waktu nyata (kuantitatif)
• Amplifikasi isotermal (misalnya, LAMP)
• Kontrol kontaminasi dan positif palsu

Mechanisms

Dalam PCR, DNA beruntai ganda didenaturasi panas menjadi untai tunggal, primer oligonukleotida pendek menempel pada sekuens yang mengapit target, dan DNA polimerase termostabil memperpanjang primer untuk mensintesis untai komplementer baru; pengulangan siklus menggandakan target setiap putaran, menghasilkan amplifikasi eksponensial (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). Target RNA pertama-tama diubah menjadi DNA komplementer oleh transkriptase balik sebelum amplifikasi. PCR waktu nyata memantau akumulasi produk siklus demi siklus menggunakan pelapor fluoresen, memungkinkan kuantifikasi (Heid et al., 1996). Metode isotermal seperti amplifikasi isotermal yang dimediasi loop mengamplifikasi pada satu suhu, menghindari kebutuhan akan siklus termal (Notomi et al., 2000).

Clinical relevance

Teknik amplifikasi banyak digunakan untuk mendeteksi patogen dan mengkarakterisasi target genetik di laboratorium diagnostik. Entri ini menjelaskan cara kerja amplifikasi dan cara melaporkan kinerjanya; ini adalah referensi metodologis dan tidak memberikan panduan untuk memesan atau menafsirkan tes tertentu dalam perawatan pasien.

Evidence & guidelines

Pedoman MIQE (Bustin et al., 2009) menetapkan informasi minimum yang diperlukan untuk melaporkan eksperimen PCR waktu nyata kuantitatif dan merupakan referensi yang banyak dikutip untuk transparansi dan reproduktifitas. Studi primer dasar menjelaskan metode PCR asli dan kuantifikasi waktu nyata (Saiki et al., 1985; Heid et al., 1996), sementara pekerjaan selanjutnya memperkenalkan alternatif isotermal (Notomi et al., 2000).

History

PCR digagas oleh Kary Mullis dan pertama kali diterapkan pada masalah diagnostik — deteksi mutasi sel sabit — oleh Saiki dan rekan pada tahun 1985, dengan metode yang secara formal dijelaskan pada tahun 1986 (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). Pengenalan polimerase termostabil mengotomatiskan proses, dan deteksi waktu nyata pada tahun 1990-an menambahkan kemampuan kuantitatif (Heid et al., 1996). Teknik isotermal kemudian memperluas amplifikasi ke pengaturan tanpa siklus termal (Notomi et al., 2000).

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

Mengapa PCR mengamplifikasi target secara eksponensial?

Setiap siklus menyalin setiap untai target yang ada, sehingga jumlah salinan kira-kira berlipat ganda setiap putaran; setelah banyak siklus, sekuens yang dimulai sebagai beberapa molekul dapat mencapai miliaran salinan.

Bagaimana amplifikasi isotermal berbeda dari PCR?

Metode isotermal seperti amplifikasi isotermal yang dimediasi loop mengamplifikasi DNA pada satu suhu konstan menggunakan primer dan enzim khusus, menghilangkan kebutuhan akan siklus pemanasan dan pendinginan berulang yang dibutuhkan PCR konvensional.