Metode Sekuensing DNA dan RNA

Metode sekuensing menentukan urutan nukleotida yang tepat dalam DNA atau, setelah konversi, dalam RNA. Dari kimia penghentian rantai Sanger hingga platform generasi berikutnya yang sangat paralel, teknik-teknik ini memungkinkan patologi molekuler membaca gen basa demi basa, mendeteksi mutasi, dan membuat profil ekspresi gen dalam skala besar.

Definition

Metode sekuensing DNA dan RNA adalah teknik laboratorium yang membaca urutan linear basa nukleotida dalam molekul asam nukleat; RNA biasanya ditranskripsi balik menjadi DNA komplementer sebelum sekuensing.

Scope

Topik ini mencakup sekuensing generasi pertama (Sanger), sekuensing generasi berikutnya (sangat paralel), dan sekuensing RNA untuk analisis transkriptom, bersama dengan alur kerja umum persiapan pustaka, sekuensing, dan penyelarasan bacaan. Ini disajikan sebagai materi referensi metodologis daripada sebagai panduan pengujian klinis.

Key concepts

• Sekuensing penghentian rantai (Sanger)
• Sekuensing generasi berikutnya / paralel masif
• Persiapan pustaka
• Bacaan sekuensing dan cakupan
• Penyelarasan bacaan dan penentuan varian
• Sekuensing RNA (transkriptomik)
• Sekuensing bertarget, eksom, dan seluruh genom

Mechanisms

Sekuensing Sanger menggabungkan dideoksinukleotida penghenti rantai untuk menghasilkan fragmen dengan setiap panjang, yang dipisahkan berdasarkan ukuran untuk merekonstruksi urutan (Sanger et al., 1977). Sekuensing generasi berikutnya justru menyiapkan pustaka DNA terfragmentasi, memperkuatnya secara spasial, dan mengurutkan jutaan fragmen secara paralel, membaca bentangan pendek yang sinyalnya dirakit secara komputasi (Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016). Sekuensing RNA menerapkan pendekatan paralel yang sama untuk DNA komplementer yang berasal dari RNA, mengukur transkrip dan mengungkapkan pola penyambungan dan ekspresi (Wang et al., 2009). Bacaan diselaraskan ke referensi untuk mengidentifikasi varian atau mengukur kelimpahan.

Clinical relevance

Sekuensing mendukung deteksi varian terkait penyakit dan karakterisasi molekuler tumor dan patogen. Entri ini menjelaskan bagaimana metode menghasilkan data sekuens dan dimaksudkan sebagai referensi; ini tidak menyarankan pemilihan, interpretasi, atau tindakan berdasarkan tes sekuensing dalam perawatan pasien individu.

Evidence & guidelines

Metode-metode ini didasarkan pada literatur primer yang fundamental, mulai dari metode penghentian rantai Sanger tahun 1977 hingga platform pikoliter berthroughput tinggi pertama (Margulies et al., 2005) dan sekuens genom manusia (Venter et al., 2001), dengan tinjauan selanjutnya yang mensurvei satu dekade teknologi generasi berikutnya dan munculnya RNA-Seq (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

History

Metode penghentian rantai Sanger (1977) membuat sekuensing DNA menjadi rutin dan mendasari sekuensing pertama genom manusia (Venter et al., 2001). Pengenalan sekuensing paralel masif pada pertengahan tahun 2000-an secara dramatis menurunkan biaya dan meningkatkan throughput (Margulies et al., 2005), dan dalam satu dekade sekuensing generasi berikutnya dan RNA-Seq telah menjadi alat standar untuk genomik dan transkriptomik (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

Key figures

• Frederick Sanger
• J. Craig Venter
• Marcel Margulies

Seminal works

• sanger-1977
• margulies-2005
• goodwin-2016

Frequently asked questions

Bagaimana sekuensing generasi berikutnya berbeda dari sekuensing Sanger?

Sekuensing Sanger membaca satu fragmen DNA pada satu waktu menggunakan kimia penghentian rantai, sedangkan sekuensing generasi berikutnya membaca jutaan fragmen secara bersamaan dalam mode paralel masif, sangat meningkatkan throughput dan menurunkan biaya per basa.

Bisakah RNA diurutkan secara langsung?

RNA biasanya pertama-tama diubah menjadi DNA komplementer melalui transkripsi balik dan kemudian diurutkan; pendekatan RNA-Seq ini mengukur transkrip dan mengungkapkan pola penyambungan dan ekspresi.