Diagnosis Molekuler: PCR, RT-PCR, dan Amplifikasi Asam Nukleat

Diagnosis molekuler mendeteksi virus dengan mengamplifikasi dan mengidentifikasi asam nukleatnya. Reaksi berantai polimerase (PCR) dan, untuk virus RNA, PCR transkripsi-balik (RT-PCR) menyalin sekuens genom target jutaan kali sehingga bahkan sejumlah kecil genom virus menjadi terdeteksi, memberikan metode ini sensitivitas dan spesifisitas tinggi serta menjadikannya tulang punggung diagnosis virus modern.

Definition

Diagnosis molekuler adalah deteksi dan, jika diperlukan, kuantifikasi asam nukleat virus dengan teknik amplifikasi seperti PCR, RT-PCR, dan metode isotermal, yang menyalin target genom spesifik ke tingkat yang terdeteksi.

Scope

Topik ini mencakup teknik amplifikasi asam nukleat yang digunakan dalam virologi: PCR konvensional dan waktu-nyata, PCR transkripsi-balik untuk virus RNA, pengukuran kuantitatif beban virus, dan alternatif isotermal seperti amplifikasi yang dimediasi loop. Ini menjelaskan prinsip dan interpretasi pada tingkat referensi dan tidak menyediakan protokol pengujian atau saran manajemen klinis.

Core questions

• Bagaimana amplifikasi sekuens target membuat virus terdeteksi dari jumlah awal yang sangat kecil?
• Langkah tambahan apa yang dibutuhkan virus RNA dibandingkan dengan virus DNA?
• Bagaimana PCR waktu-nyata digunakan untuk mengukur beban virus, dan apa arti ambang siklus?
• Kapan format isotermal atau multipleks lebih disukai daripada PCR konvensional?

Key concepts

• Reaksi berantai polimerase (PCR)
• Transkripsi balik (RT-PCR)
• Primer dan spesifisitas target
• Siklus termal dan amplifikasi eksponensial
• PCR waktu-nyata (kuantitatif)
• Ambang siklus dan beban virus
• Amplifikasi multipleks
• Amplifikasi isotermal (misalnya, LAMP)

Mechanisms

PCR menggunakan dua primer pendek yang mengapit wilayah genom virus yang dipilih, polimerase DNA termostabil, dan siklus pemanasan dan pendinginan berulang. Setiap siklus mendenaturasi DNA, menempelkan primer, dan memperpanjang untai baru, menggandakan target sehingga terakumulasi secara eksponensial. Untuk virus RNA, langkah transkripsi-balik terlebih dahulu mengubah genom RNA menjadi DNA komplementer sebelum amplifikasi. PCR waktu-nyata memantau akumulasi produk siklus demi siklus menggunakan pelapor fluoresen, memungkinkan kuantifikasi: ambang siklus di mana sinyal naik di atas latar belakang berbanding terbalik dengan jumlah templat awal, memberikan perkiraan beban virus. Desain multipleks mengamplifikasi beberapa target sekaligus, dan metode isotermal seperti amplifikasi yang dimediasi loop mencapai amplifikasi pada suhu konstan, mengurangi persyaratan instrumen untuk pengujian terdesentralisasi.

Clinical relevance

Amplifikasi asam nukleat menyediakan deteksi infeksi virus aktif yang sensitif dan spesifik serta mendukung pemantauan beban virus yang digunakan untuk mengikuti infeksi dan respons pengobatan. Entri ini menjelaskan bagaimana metode bekerja dan bagaimana hasil seperti ambang siklus diinterpretasikan secara prinsip, termasuk poin bahwa deteksi genom itu sendiri tidak membuktikan adanya virus infeksius; ini bersifat deskriptif metodologi dan bukan dasar untuk keputusan diagnostik atau pengobatan individu.

Epidemiology

RT-PCR waktu-nyata menjadi metode referensi untuk mengkonfirmasi infeksi SARS-CoV-2, dan publikasi cepat pengujian yang tervalidasi pada awal tahun 2020 memungkinkan peningkatan skala pengujian molekuler secara global, menggambarkan bagaimana amplifikasi asam nukleat mendukung deteksi dan pengawasan wabah.

History

Reaksi berantai polimerase digagas oleh Kary Mullis dan pertama kali diterapkan pada diagnosis genetik oleh Saiki dan rekan pada tahun 1985, dengan metode tersebut diformalkan oleh Mullis dan Faloona pada tahun 1987. PCR kuantitatif waktu-nyata, yang dijelaskan oleh Heid dan rekan pada tahun 1996, menambahkan kuantifikasi berkelanjutan, dan metode isotermal seperti amplifikasi yang dimediasi loop, yang diperkenalkan oleh Notomi dan rekan pada tahun 2000, memperluas di mana amplifikasi dapat dilakukan.

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Christian Drosten

Seminal works

• saiki-1985
• mullis-faloona-1987
• heid-1996
• corman-2020

Frequently asked questions

Apa perbedaan antara PCR dan RT-PCR?

PCR mengamplifikasi DNA, sehingga digunakan langsung untuk virus DNA. RT-PCR menambahkan langkah transkripsi-balik yang mengubah genom RNA virus menjadi DNA komplementer terlebih dahulu, memungkinkan virus RNA seperti influenza dan coronavirus terdeteksi.

Apakah hasil PCR positif berarti virus infeksius ada?

Belum tentu. PCR mendeteksi genom virus, yang dapat bertahan setelah virus tidak lagi bereplikasi atau infeksius. Menentukan keberadaan virus infeksius memerlukan kultur atau pengujian fungsional lainnya yang diinterpretasikan dalam konteks klinis.