PCR dan Amplifikasi Asam Nukleat

Reaksi berantai polimerase — metode siklik yang diarahkan oleh primer yang menyalin segmen DNA yang dipilih secara eksponensial — dan keluarga teknik amplifikasi yang lebih luas yang dibangun di atasnya.

Definition

Reaksi berantai polimerase adalah metode in vitro yang mengamplifikasi daerah DNA tertentu secara eksponensial melalui siklus berulang pemisahan untai, penempelan primer pengapit, dan ekstensi oleh DNA polimerase termostabil; amplifikasi asam nukleat secara lebih luas mencakup teknik terkait untuk menyalin sekuens DNA atau RNA.

Scope

Topik ini mencakup prinsip dan varian amplifikasi asam nukleat: siklus termal denaturasi, penempelan primer, dan ekstensi yang mendefinisikan reaksi berantai polimerase; peran primer dan polimerase termostabil; serta ekstensi seperti transkripsi balik dan amplifikasi kuantitatif waktu nyata. Topik ini membahas metode dan logikanya; sekuensing dan kloning yang menggunakan DNA yang diamplifikasi dibahas dalam topik-topik pendamping.

Core questions

• Bagaimana siklus pemanasan dan pendinginan berulang mengamplifikasi daerah DNA tertentu?
• Mengapa dua primer dan polimerase termostabil sangat penting?
• Bagaimana amplifikasi menjadi eksponensial?
• Bagaimana metode ini diperluas untuk mengkuantifikasi asam nukleat atau untuk mengamplifikasi RNA?

Key theories

Amplifikasi eksponensial yang ditentukan primer

Sepasang primer yang mengapit target mendefinisikan daerah yang diamplifikasi, dan karena setiap untai baru berfungsi sebagai templat dalam siklus berikutnya, jumlah salinan target kira-kira berlipat ganda per siklus, tumbuh secara eksponensial.

Polimerase termostabil memungkinkan siklus

Penggunaan DNA polimerase yang stabil terhadap panas memungkinkan denaturasi suhu tinggi berulang tanpa menambahkan kembali enzim, membuat siklus termal otomatis menjadi praktis dan reaksi menjadi kuat.

Mechanisms

Setiap siklus memanaskan sampel untuk memisahkan untai DNA, mendinginkannya sehingga dua primer menempel pada sekuens yang mengapit target pada untai yang berlawanan, dan menghangatkannya ke suhu ekstensi di mana polimerase termostabil mensintesis untai baru dari primer. Karena produk dari satu siklus menjadi templat untuk siklus berikutnya, daerah target diamplifikasi secara eksponensial selama banyak siklus. Varian termasuk amplifikasi transkripsi balik, yang pertama-tama menyalin RNA menjadi DNA, dan amplifikasi kuantitatif waktu nyata, yang memantau akumulasi produk untuk mengukur jumlah awal.

Clinical relevance

Amplifikasi sangat penting untuk pengujian genetik, deteksi patogen, dan identifikasi forensik; disajikan sebagai signifikansi daripada panduan klinis.

History

Mullis mengemukakan reaksi berantai polimerase pada awal 1980-an, dan laporan tahun 1985 oleh Saiki dan rekan menunjukkan penggunaannya, dengan adopsi polimerase termostabil kemudian menjadikannya rutin; penemuan ini diakui oleh Hadiah Nobel Kimia tahun 1993.

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki1985
• lodish2016

Frequently asked questions

Mengapa PCR membutuhkan primer?

Primer menentukan titik awal sintesis pada setiap untai, sehingga mereka menentukan daerah mana yang disalin dan memungkinkan polimerase memulai ekstensi.

Apa yang membuat amplifikasi menjadi eksponensial?

Untai baru setiap siklus menjadi templat dalam siklus berikutnya, sehingga jumlah salinan target kira-kira berlipat ganda setiap siklus.