Analisis Kuantitatif Waktu Nyata dan Penilaian Jumlah Salinan

Metode molekuler kuantitatif mengukur seberapa banyak asam nukleat target yang ada, bukan hanya apakah asam nukleat tersebut dapat dideteksi. PCR kuantitatif waktu nyata melacak amplifikasi saat terjadi, PCR digital mempartisi sampel untuk menghitung molekul secara absolut, dan penilaian jumlah salinan menentukan apakah suatu wilayah genom diperoleh atau hilang.

Definition

Analisis kuantitatif waktu nyata mengukur jumlah asam nukleat target, biasanya dengan memantau sinyal fluoresen selama amplifikasi (PCR waktu nyata) atau dengan menghitung partisi positif (PCR digital); penilaian jumlah salinan menentukan jumlah salinan suatu wilayah genom relatif terhadap referensi.

Scope

Topik ini mencakup PCR waktu nyata (kuantitatif), PCR digital dan droplet digital, serta pendekatan untuk penilaian jumlah salinan. Ini membahas prinsip-prinsip kuantifikasi dan pertimbangan yang membuat hasilnya sebanding, disajikan sebagai materi referensi metodologis daripada sebagai panduan pengujian klinis.

Key concepts

• PCR waktu nyata (kuantitatif)
• Siklus kuantifikasi (Cq) dan efisiensi amplifikasi
• Kurva standar dan kuantifikasi relatif
• PCR digital dan droplet digital
• Kuantifikasi absolut dengan partisi
• Perolehan dan kehilangan jumlah salinan
• Standar pelaporan dan reproduktifitas

Mechanisms

PCR waktu nyata menggabungkan amplifikasi dengan pelapor fluoresen yang sinyalnya meningkat sebanding dengan akumulasi produk; siklus di mana sinyal melewati ambang batas mencerminkan jumlah awal target, memungkinkan kuantifikasi relatif atau kurva standar (Heid et al., 1996). PCR digital justru mendistribusikan sampel ke dalam banyak partisi kecil sehingga masing-masing mengandung nol atau beberapa molekul; menghitung fraksi partisi positif dan menerapkan statistik Poisson menghasilkan hitungan absolut tanpa kurva standar (Hindson et al., 2011). Penilaian jumlah salinan membandingkan kelimpahan wilayah target dengan referensi untuk mendeteksi amplifikasi atau delesi, sebuah ide yang dipelopori oleh hibridisasi genomik komparatif (Kallioniemi et al., 1992).

Clinical relevance

Metode kuantitatif dan jumlah salinan digunakan untuk mengukur beban patogen, ekspresi gen, dan perolehan atau kehilangan genomik. Entri ini menjelaskan cara kerja kuantifikasi sebagai referensi metodologis; ini tidak menyarankan pemilihan, interpretasi, atau tindakan pada uji kuantitatif spesifik apa pun dalam perawatan pasien.

Evidence & guidelines

Pelaporan PCR kuantitatif dipandu oleh rekomendasi MIQE, yang menentukan informasi minimum yang diperlukan untuk publikasi yang dapat direproduksi (Bustin et al., 2009). Studi primer dasar menjelaskan kuantifikasi waktu nyata (Heid et al., 1996), kuantifikasi digital absolut (Hindson et al., 2011), dan pengukuran jumlah salinan di seluruh genom (Kallioniemi et al., 1992).

History

PCR waktu nyata pada pertengahan 1990-an mengubah amplifikasi dari alat kualitatif menjadi kuantitatif (Heid et al., 1996), dan standar pelaporan konsensus menyusul satu dekade kemudian (Bustin et al., 2009). PCR digital, dan khususnya PCR digital droplet, kemudian memungkinkan penghitungan molekul secara absolut dengan presisi tinggi (Hindson et al., 2011), sementara penilaian jumlah salinan berevolusi dari hibridisasi genomik komparatif menuju metode berbasis array dan sekuensing (Kallioniemi et al., 1992).

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

Bagaimana PCR digital berbeda dari PCR kuantitatif waktu nyata?

PCR waktu nyata memperkirakan jumlah awal target dari seberapa awal sinyal fluoresen melewati ambang batas, biasanya relatif terhadap standar, sedangkan PCR digital mempartisi sampel dan menghitung kompartemen positif untuk memberikan hitungan molekul absolut tanpa kurva standar.

Apa yang diukur oleh penilaian jumlah salinan?

Ini menentukan berapa banyak salinan dari wilayah genom tertentu yang ada relatif terhadap referensi, mengidentifikasi amplifikasi (perolehan) atau delesi (kehilangan) dari wilayah tersebut.