Profil Ekspresi Berbasis Mikroarray

Mikroarray DNA mengukur ekspresi gen dengan menghibridisasi asam nukleat berlabel dari sampel ke kisi padat dan teratur dari probe komplementer yang terpasang pada permukaan padat; fluoresensi pada setiap probe mencerminkan seberapa banyak transkrip yang sesuai hadir. Mikroarray menjadikan profil ekspresi skala genom rutin pada akhir 1990-an dan 2000-an dan tetap menjadi platform yang terdefinisi dan hemat biaya di mana kumpulan transkrip yang akan diukur diketahui sebelumnya.

Definition

Profil ekspresi berbasis mikroarray mengukur kelimpahan transkrip dengan mengukur sinyal hibridisasi asam nukleat sampel berlabel ke susunan tetap DNA komplementer atau probe oligonukleotida, menghasilkan nilai ekspresi relatif untuk setiap gen yang diuji.

Scope

Topik ini mencakup desain dan penggunaan mikroarray ekspresi: tata letak probe, pelabelan dan hibridisasi sampel, akuisisi sinyal berbasis gambar, serta normalisasi dan ringkasan yang diperlukan untuk mengubah intensitas probe mentah menjadi nilai ekspresi yang sebanding. Ini adalah referensi metodologis dalam transkriptomik dan tidak menawarkan panduan klinis.

Core questions

• Bagaimana probe dirancang dan disusun untuk merepresentasikan gen yang diminati?
• Bagaimana sinyal hibridisasi berhubungan dengan kelimpahan transkrip?
• Bagaimana intensitas probe mentah dinormalisasi dan diringkas menjadi nilai ekspresi per gen?
• Kapan susunan probe tetap lebih disukai daripada pengurutan transkrip secara langsung?

Key concepts

• Desain probe dan susunan
• Hibridisasi dan pelabelan fluoresen
• Susunan dua warna versus satu saluran
• Koreksi latar belakang dan normalisasi
• Ringkasan tingkat probe (misalnya, RMA)
• Hibridisasi silang dan saturasi
• Set probe tetap (pengukuran tertutup)

Mechanisms

DNA atau RNA komplementer berlabel yang disiapkan dari sampel diterapkan ke susunan di mana ribuan probe dengan urutan yang diketahui terpasang pada posisi yang dapat dialamatkan. Molekul komplementer berhibridisasi dengan probe-nya, dan pemindai merekam intensitas fluoresensi pada setiap titik, yang diambil sebagai ukuran relatif kelimpahan transkrip yang cocok. Karena intensitas dipengaruhi oleh latar belakang, afinitas probe, dan variasi antar-susunan, sinyal mentah harus dikoreksi latar belakang, dinormalisasi di seluruh susunan, dan diringkas dari beberapa probe per gen menjadi satu estimasi ekspresi; metode Robust Multi-array Average (RMA) dari Irizarry dan rekan adalah kerangka kerja ringkasan yang banyak digunakan. Schena dan rekan memperkenalkan mikroarray cDNA, dan Lockhart serta rekan menetapkan susunan oligonukleotida kepadatan tinggi sebagai platform pemantauan ekspresi kuantitatif.

Clinical relevance

Mikroarray menghasilkan klasifikasi molekuler penyakit yang berpengaruh dan merupakan platform di balik beberapa tanda ekspresi gen awal yang digunakan dalam penelitian dan pengaturan translasi. Sebagai topik referensi, entri ini menjelaskan bagaimana bukti ekspresi berbasis susunan dihasilkan dan dinormalisasi; ini bukan dasar untuk keputusan diagnostik atau pengobatan individu.

Evidence & guidelines

Dasar-dasar metodologis adalah makalah platform dari Schena dan rekan (susunan cDNA) dan Lockhart dan rekan (susunan oligonukleotida), bersama dengan metode normalisasi dan ringkasan seperti RMA (Irizarry dan rekan). Ini adalah referensi metodologis daripada pedoman klinis.

History

Mikroarray ekspresi diperkenalkan pada pertengahan 1990-an, dengan Schena dan rekan mendemonstrasikan mikroarray cDNA pada tahun 1995 dan Lockhart serta rekan menjelaskan susunan oligonukleotida kepadatan tinggi pada tahun 1996. Selama dekade berikutnya, susunan menjadi alat dominan untuk studi ekspresi skala genom, dan metode statistik untuk normalisasi dan ringkasan probe menjadi matang. Sejak akhir 2000-an, pengurutan RNA secara progresif menggantikan susunan untuk pekerjaan penemuan, meskipun susunan tetap digunakan di mana set probe yang terdefinisi dan biaya yang lebih rendah menguntungkan.

Debates

Mikroarray versus pengurutan RNA

Mikroarray hanya mengukur transkrip yang direpresentasikan oleh probe tetapnya dan memiliki rentang dinamis yang lebih sempit, sedangkan pengurutan mengukur transkrip secara langsung dan dapat menemukan yang baru; pertukaran antara uji tertutup yang terdefinisi dan lebih murah dengan platform penemuan terbuka terus menjadi pertimbangan dalam pemilihan platform.

Key figures

• Patrick O. Brown
• Mark Schena
• David J. Lockhart
• Rafael Irizarry

Seminal works

• schena-1995
• lockhart-1996
• irizarry-2003

Frequently asked questions

Mengapa mikroarray hanya dapat mengukur transkrip yang dirancangnya?

Sinyal muncul dari hibridisasi ke probe dengan urutan yang diketahui yang terpasang pada susunan, sehingga transkrip apa pun tanpa probe yang cocok tidak dapat dideteksi. Ini menjadikan mikroarray sebagai uji tertutup, berbeda dengan pengurutan, yang mengambil sampel transkrip secara langsung.

Apa yang dikoreksi oleh normalisasi dalam data mikroarray?

Ini menyesuaikan variasi teknis seperti latar belakang yang berbeda, efisiensi pelabelan, dan perbedaan intensitas antar-susunan, sehingga nilai ekspresi yang dihasilkan mencerminkan perbedaan biologis daripada artefak eksperimental.