Metode dan Teknologi Sekuensing RNA

Sekuensing RNA (RNA-seq) mengukur transkriptom dengan mengubah RNA menjadi pustaka sekuensing dan menghitung pembacaan (reads) yang dihasilkan yang dipetakan kembali ke gen dan transkrip. Dengan mengambil sampel transkrip secara langsung daripada menghibridisasikannya ke probe yang telah ditentukan, RNA-seq dapat mengukur ekspresi di seluruh rentang dinamis yang luas, menemukan transkrip dan sambungan (splice junction) yang sebelumnya tidak dianotasi, dan menyelesaikan struktur isoform.

Definition

Sekuensing RNA adalah pendekatan sekuensing berdaya tinggi di mana RNA ditranskripsi balik (atau diurutkan secara langsung) dan bacaan yang dihasilkan dipetakan dan dihitung untuk mengukur kelimpahan transkrip dan mengkarakterisasi struktur transkrip di seluruh transkriptom.

Scope

Topik ini mencakup alur kerja eksperimental dan komputasi RNA-seq: seleksi RNA dan persiapan pustaka, kimia sekuensing baca-pendek dan baca-panjang, penyelarasan (alignment) atau pseudo-penyelarasan bacaan, serta kuantifikasi dan normalisasi ekspresi. Ini adalah referensi metodologis dalam transkriptomika dan tidak memberikan panduan klinis.

Core questions

• Bagaimana sampel RNA diubah menjadi pustaka sekuensing, dan langkah-langkah seleksi apa (penipisan poli-A atau ribosom) yang membentuk apa yang diukur?
• Bagaimana bacaan diselaraskan atau pseudo-diselaraskan ke referensi, dan dikuantifikasi per gen atau transkrip?
• Bagaimana normalisasi dilakukan agar ekspresi dapat dibandingkan antar sampel?
• Apa yang ditambahkan oleh teknologi baca-panjang dan RNA-langsung dibandingkan sekuensing baca-pendek?

Key concepts

• Persiapan pustaka dan seleksi poli-A atau penipisan rRNA
• Sekuensing baca-pendek versus baca-panjang
• Penyelarasan bacaan dan pseudo-penyelarasan
• Penghitungan dan kuantifikasi bacaan
• Normalisasi (misalnya, unit seperti FPKM/TPM)
• Kedalaman dan cakupan sekuensing
• Deteksi sambungan (splice-junction)
• Sekuensing RNA langsung

Mechanisms

Dalam alur kerja tipikal, RNA diekstraksi dan sebagian dipilih (umumnya RNA duta yang terpolia-adenilasi, atau total RNA setelah penipisan RNA ribosom), difragmentasi, ditranskripsi balik menjadi DNA komplementer, dan dibangun menjadi pustaka yang diligasi adaptor. Pustaka tersebut diurutkan untuk menghasilkan jutaan bacaan, yang diselaraskan dengan genom atau transkriptom referensi, atau dikuantifikasi dengan pseudo-penyelarasan tanpa penyelarasan. Bacaan yang tumpang tindih dengan setiap fitur dihitung; karena transkrip yang lebih panjang dan sampel yang diurutkan lebih dalam mengumpulkan lebih banyak bacaan, hitungan dinormalisasi untuk panjang transkrip dan ukuran pustaka sebelum kelimpahan dibandingkan. Mortazavi dan rekan memperkenalkan kerangka kerja penghitungan dan normalisasi inti, dan tinjauan oleh Wang serta oleh Ozsolak menguraikan kekuatan dan keterbatasan platform tersebut. Teknologi baca-panjang dan RNA-langsung mengurutkan molekul utuh, meningkatkan resolusi isoform dengan biaya kesalahan per-bacaan yang lebih tinggi dan throughput yang lebih rendah.

Clinical relevance

RNA-seq menghasilkan sebagian besar bukti klasifikasi molekuler dan penemuan biomarker dalam penelitian dan genomika translasi, dan semakin mendukung deteksi transkrip diagnostik dan fusi. Sebagai topik referensi, ini menjelaskan bagaimana bukti transkriptomik diproduksi; ini bukan dasar untuk keputusan diagnostik atau pengobatan individu.

Evidence & guidelines

Kerangka kerja praktik terbaik untuk RNA-seq berasal dari pekerjaan kuantifikasi dasar Mortazavi dan rekan serta dari tinjauan metode (Wang dan rekan; Ozsolak dan Milos). Analisis baca-panjang menambahkan pertimbangannya sendiri, yang disurvei oleh Amarasinghe dan rekan. Ini adalah referensi metodologis daripada pedoman praktik klinis.

History

RNA-seq muncul pada tahun 2008 ketika sekuensing baca-pendek berdaya tinggi diterapkan pada RNA yang ditranskripsi balik, dengan Mortazavi dan rekan menetapkan cara memetakan dan menguantifikasi transkriptom mamalia dari hitungan bacaan. Tinjauan selama tahun-tahun berikutnya mengonsolidasikan persiapan pustaka dan standar analisis, dan sejak pertengahan 2010-an platform baca-panjang dan RNA-langsung memperluas pendekatan menuju sekuensing isoform utuh.

Debates

Sekuensing baca-pendek versus baca-panjang

Bacaan pendek menawarkan throughput tinggi dan kesalahan per-basa rendah tetapi merekonstruksi isoform hanya secara tidak langsung, sedangkan bacaan panjang mengurutkan transkrip utuh dan menyelesaikan isoform secara langsung dengan biaya tingkat kesalahan yang lebih tinggi dan kedalaman yang lebih rendah; pilihan yang tepat bergantung pada apakah kuantifikasi akurat atau struktur isoform adalah prioritas.

Key figures

• Barbara Wold
• Ali Mortazavi
• Michael Snyder

Seminal works

• mortazavi-2008
• wang-2009
• ozsolak-2011

Frequently asked questions

Apa perbedaan antara seleksi poli-A dan penipisan RNA ribosom?

Seleksi poli-A menangkap RNA duta terpolia-adenilasi dan efisien untuk transkrip pengkode protein, sedangkan penipisan RNA ribosom menghilangkan rRNA yang melimpah sambil mempertahankan transkrip non-polia-adenilasi dan terdegradasi. Pilihan ini menentukan spesies RNA mana yang dapat diukur oleh eksperimen.

Mengapa hitungan RNA-seq dinormalisasi sebelum perbandingan?

Hitungan bacaan mentah bergantung pada panjang transkrip dan seberapa dalam setiap sampel diurutkan, sehingga tidak dapat dibandingkan secara langsung. Normalisasi menyesuaikan faktor-faktor ini sehingga perbedaan kelimpahan mencerminkan biologi daripada kedalaman teknis atau panjang.