इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस ऊतक खंड के भीतर विशिष्ट अणुओं का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं। एक एंटीबॉडी अपने लक्ष्य एंटीजन को यथास्थान बांधती है और फिर उसे दृश्यमान बनाया जाता है — एक एंजाइम द्वारा जो रंगीन उत्पाद जमा करता है (IHC) या एक फ्लोरोसेंट लेबल द्वारा जिसे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाता है (इम्यूनोफ्लोरेसेंस) — जिससे उन कोशिका प्रकारों और अणुओं की पहचान की जा सकती है जिन्हें नियमित दाग अलग नहीं कर सकते।

Definition

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस एंटीबॉडी-आधारित विधियाँ हैं जो ऊतक खंडों में विशिष्ट एंटीजन को लेबल किए गए एंटीबॉडी को उनके लक्ष्यों से बांधकर और एंजाइमेटिक रंग प्रतिक्रियाओं (इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री) या फ्लोरेसेंस (इम्यूनोफ्लोरेसेंस) के माध्यम से बंधे हुए लेबल का पता लगाकर स्थानीयकृत करती हैं।

Scope

यह विषय एंटीबॉडी-आधारित लेबलिंग के सिद्धांत, प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष पहचान, सिग्नल-एम्प्लीफिकेशन सिस्टम, एंटीजन रिट्रीवल, और इन एसेज़ के सत्यापन और गुणवत्ता नियंत्रण को शामिल करता है। यह एक कार्यप्रणाली संबंधी संदर्भ है और नैदानिक व्याख्या या उपचार मार्गदर्शन प्रदान नहीं करता है।

Core questions

• एक एंटीबॉडी ऊतक में अणु-विशिष्ट स्थानीयकरण कैसे प्राप्त करती है?
• प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष पहचान योजनाएँ कैसे भिन्न होती हैं?
• एम्प्लीफिकेशन सिस्टम और एंटीजन रिट्रीवल संवेदनशीलता में कैसे सुधार करते हैं?
• विश्वसनीय व्याख्या के लिए एंटीबॉडी-आधारित एसेज़ का सत्यापन और नियंत्रण कैसे किया जाता है?

Key concepts

• एंटीजन-एंटीबॉडी बंधन विशिष्टता
• प्रत्यक्ष बनाम अप्रत्यक्ष पहचान
• सिग्नल एम्प्लीफिकेशन (जैसे एविडिन-बायोटिन, पॉलीमर सिस्टम)
• क्रोमोजेनिक बनाम फ्लोरोसेंट लेबल
• एंटीजन (एपिटोप) रिट्रीवल
• नियंत्रण और एसे सत्यापन
• विशिष्टता और क्रॉस-रिएक्टिविटी

Mechanisms

मुख्य घटना खंड के भीतर एक एंटीबॉडी का उसके एंटीजन से विशिष्ट बंधन है। प्रत्यक्ष विधि में प्राथमिक एंटीबॉडी स्वयं लेबल वहन करती है; अप्रत्यक्ष विधि में एक अचिह्नित प्राथमिक एंटीबॉडी को एक लेबल किए गए द्वितीयक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है, जो पहचान को बढ़ाता और मानकीकृत करता है। कून्स और उनके सहयोगियों ने पहली बार दिखाया कि एक फ्लोरोसेंट समूह के साथ टैग की गई एंटीबॉडी ऊतक में अपने एंटीजन को स्थानीयकृत कर सकती है (कून्स, 1941), जिससे इम्यूनोफ्लोरेसेंस की स्थापना हुई। एंजाइम-आधारित पहचान ने फिर स्थायी क्रोमोजेनिक संकेतों की अनुमति दी, और एविडिन-बायोटिन-परऑक्सीडेज़ कॉम्प्लेक्स (हसू एट अल।, 1981) जैसे एम्प्लीफिकेशन सिस्टम और, बाद में, पॉलीमर-आधारित पहचान द्वारा संवेदनशीलता बढ़ाई गई। क्योंकि एल्डिहाइड फिक्सेशन क्रॉस-लिंकिंग के माध्यम से एपिटोप्स को मास्क कर सकता है, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक में एंटीबॉडी बंधन को बहाल करने के लिए अक्सर गर्मी- या प्रोटीज-आधारित एंटीजन-रिट्रीवल चरणों का उपयोग किया जाता है (शी एट अल।, 1991)। विश्वसनीय व्याख्या उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों और प्रत्येक एसे के औपचारिक विश्लेषणात्मक सत्यापन पर निर्भर करती है (फिट्ज़गिबन्स एट अल।, 2014)।

Clinical relevance

एंटीबॉडी-आधारित लेबलिंग कोशिका वंश और विशिष्ट आणविक मार्करों की पहचान करके आधुनिक ऊतक-आधारित निदान और अनुसंधान का आधार है। यह प्रविष्टि विधियों और उनकी गुणवत्ता आवश्यकताओं का वैचारिक रूप से वर्णन करती है; यह एक संदर्भ अभिविन्यास है न कि व्यक्तिगत नैदानिक या उपचार निर्णयों का आधार।

Evidence & guidelines

इम्यूनोहिस्टोकेमिकल एसेज़ के विश्लेषणात्मक सत्यापन पर व्यावसायिक मार्गदर्शन कॉलेज ऑफ अमेरिकन पैथोलॉजिस्ट (फिट्ज़गिबन्स एट अल।, 2014) द्वारा जारी किया गया है, और विधि सिद्धांत मानक हिस्टोटेक्नोलॉजी संदर्भों (सुवर्ण एट अल।, 2018) में समेकित हैं। एंटीजन-रिट्रीवल और एम्प्लीफिकेशन विधियाँ मूलभूत प्राथमिक अध्ययनों (शी एट अल।, 1991; हसू एट अल।, 1981) से प्राप्त हुई हैं।

History

एंटीबॉडी-आधारित स्थानीयकरण 1941 में कून्स और उनके सहयोगियों की फ्लोरोसेंट-एंटीबॉडी विधि से शुरू हुआ, जिसने ऊतक में अणु-विशिष्ट पहचान को संभव बनाया। एंजाइम-लेबल विधियों ने बाद में स्थायी दृश्य संकेत दिए, एविडिन-बायोटिन-परऑक्सीडेज़ कॉम्प्लेक्स (हसू एट अल।, 1981) जैसे एम्प्लीफिकेशन सिस्टम ने संवेदनशीलता बढ़ाई, और गर्मी-प्रेरित एंटीजन रिट्रीवल (शी एट अल।, 1991) ने नियमित रूप से फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड सामग्री तक विश्वसनीय इम्यूनोस्टेनिंग का विस्तार किया। मानकीकरण और सत्यापन मार्गदर्शन तब आया जब ये विधियाँ नैदानिक अभ्यास के लिए केंद्रीय हो गईं (फिट्ज़गिबन्स एट अल।, 2014)।

Key figures

• Albert Coons
• Su-Ming Hsu
• Shan-Rong Shi

Seminal works

• coons-1941
• hsu-1981
• shi-1991

Frequently asked questions

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस में क्या अंतर है?

दोनों ऊतक में एंटीजन को स्थानीयकृत करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं; इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एक एंजाइम के माध्यम से बंधे हुए एंटीबॉडी को दृश्यमान बनाती है जो प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे गए रंगीन उत्पाद को जमा करता है, जबकि इम्यूनोफ्लोरेसेंस फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत देखे गए फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करता है।

एंटीजन रिट्रीवल की अक्सर आवश्यकता क्यों होती है?

फॉर्मेलिन फिक्सेशन प्रोटीन को क्रॉस-लिंक करता है और उन एपिटोप्स को मास्क कर सकता है जिन्हें एंटीबॉडी पहचानते हैं; गर्मी- या एंजाइम-आधारित एंटीजन-रिट्रीवल चरण इन एपिटोप्स को अनमास्क कर सकते हैं ताकि फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक में स्टेनिंग संभव हो सके।