इम्यूनोफ्लोरेसेंस और प्रोटीन स्थानीयकरण

इम्यूनोफ्लोरेसेंस कोशिकाओं और ऊतकों के भीतर विशिष्ट अणुओं का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट रंगों से जुड़े एंटीबॉडी का उपयोग करता है, ताकि एक लक्ष्य प्रोटीन या एंटीजन जहां भी स्थित हो, वहां चमक उठे। यह एंटीबॉडी बंधन की विशिष्टता को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के कंट्रास्ट से जोड़ता है और यह कोशिका में प्रोटीन के स्थान का मानचित्रण करने के लिए एक प्राथमिक विधि है।

Definition

इम्यूनोफ्लोरेसेंस (फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी तकनीक) एक ऐसी विधि है जिसमें फ्लोरोफोरस से जुड़े एंटीबॉडी एक लक्ष्य एंटीजन को बांधते हैं ताकि कोशिका या ऊतक के भीतर इसकी स्थिति को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जा सके; प्रोटीन स्थानीयकरण यह निर्धारित करना है कि एक दिया गया प्रोटीन कोशिका में कहाँ रहता है।

Scope

यह प्रविष्टि एंटीबॉडी-आधारित फ्लोरोसेंट लेबलिंग के सिद्धांत, प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष पहचान योजनाओं और सेलुलर डिब्बों में प्रोटीन को स्थानीयकृत करने के लिए विधि के उपयोग को शामिल करती है। यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस को सेल इमेजिंग के भीतर एक स्थानीयकरण विधि के रूप में मानता है न कि नैदानिक निर्देश के रूप में।

Core questions

• एक एंटीबॉडी फ्लोरोसेंट सिग्नल पर आणविक विशिष्टता कैसे प्रदान करता है?
• प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस में क्या अंतर है?
• एक प्रोटीन को एक विशेष सेलुलर डिब्बे में कैसे सौंपा जाता है?
• गैर-विशिष्ट या झूठे संकेतों से कौन से नियंत्रण बचाव करते हैं?

Key concepts

• एंटीबॉडी-एंटीजन विशिष्टता
• फ्लोरोफोर संयुग्मन
• प्रत्यक्ष बनाम अप्रत्यक्ष पहचान
• सह-स्थानीयकरण
• उपकोशिकीय डिब्बे का असाइनमेंट
• विशिष्टता नियंत्रण

Mechanisms

एक लक्ष्य एंटीजन के खिलाफ विकसित एक एंटीबॉडी को एक फ्लोरोसेंट डाई से जोड़ा जाता है, जैसा कि कून और सहयोगियों द्वारा पहली बार प्रदर्शित किया गया था, ताकि बंधन माइक्रोस्कोपी द्वारा पठनीय एक फ्लोरोसेंट सिग्नल के साथ एंटीजन की स्थिति को चिह्नित करे; कून और कपलान ने ऊतक विधि को परिष्कृत किया ताकि कोशिकाओं में एंटीजन का विश्वसनीय रूप से पता लगाया जा सके। प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस में लेबल किया गया एंटीबॉडी स्वयं लक्ष्य को बांधता है, जबकि अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस में एक अचिह्नित प्राथमिक एंटीबॉडी को एक लेबल किए गए द्वितीयक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है, जिससे सिग्नल प्रवर्धित होता है। स्थानीयकरण को इस बात से पढ़ा जाता है कि सिग्नल ज्ञात मार्करों के सापेक्ष कहाँ गिरता है, और गिएपमैन्स और सहयोगियों द्वारा समीक्षा की गई विस्तारित फ्लोरोसेंट टूलबॉक्स — जिसमें फ्लोरोसेंट प्रोटीन शामिल हैं — ऐसे स्थानीयकरण को जीवित कोशिकाओं तक विस्तारित करता है, जबकि शर्मीलेह और सहयोगियों द्वारा सर्वेक्षण की गई सुपर-रिज़ॉल्यूशन विधियाँ इसे विवर्तन सीमा से नीचे तेज करती हैं। पृष्ठभूमि से वास्तविक बंधन को अलग करने के लिए विशिष्टता नियंत्रण आवश्यक हैं।

Clinical relevance

इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग नैदानिक रूप से किया जाता है — उदाहरण के लिए गुर्दे और त्वचा की बायोप्सी पर और ऑटोएंटीबॉडी का पता लगाने में — और प्रोटीन को स्थानीयकृत करने के लिए अनुसंधान में व्यापक रूप से। यह प्रविष्टि बताती है कि स्थानीयकरण सिग्नल कैसे उत्पन्न और व्याख्या किया जाता है और यह संदर्भ-शैक्षिक है, न कि व्यक्तिगत नैदानिक या उपचार निर्णयों का आधार।

History

अल्बर्ट कून और सहयोगियों ने 1941 के आसपास फ्लोरोसेंट-एंटीबॉडी लेबलिंग की शुरुआत की और 1950 तक ऊतक एंटीजन पहचान के लिए इसे परिष्कृत किया, जिससे इम्यूनोफ्लोरेसेंस की स्थापना हुई। उज्ज्वल फ्लोरोफोरस और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन का बाद में आगमन, गिएपमैन्स और सहयोगियों के फ्लोरोसेंट टूलबॉक्स में सूचीबद्ध, और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग ने उस सटीकता को बहुत बढ़ा दिया जिसके साथ कोशिकाओं में प्रोटीन को स्थानीयकृत किया जा सकता है।

Key figures

• Albert Coons
• Roger Tsien
• Mark Ellisman

Seminal works

• coons-1941
• coons-1950
• giepmans-2006

Frequently asked questions

प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस में क्या अंतर है?

प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस में फ्लोरोफोर उस एंटीबॉडी से जुड़ा होता है जो लक्ष्य को बांधता है; अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस में एक लेबल किया गया द्वितीयक एंटीबॉडी एक अचिह्नित प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाता है, जो सिग्नल को प्रवर्धित करता है।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस कैसे दिखाता है कि कोशिका में प्रोटीन कहाँ है?

एंटीबॉडी केवल अपने विशिष्ट एंटीजन को बांधता है, इसलिए फ्लोरोसेंट सिग्नल जहां भी वह प्रोटीन स्थित होता है, वहां दिखाई देता है, और ज्ञात सेलुलर मार्करों के सापेक्ष इसकी स्थिति उस डिब्बे को प्रकट करती है जिस पर वह कब्जा करता है।