هیبریداسیون درجا با فلورسانس (FISH)

هیبریداسیون درجا با فلورسانس (FISH) یک تکنیک سیتوژنتیک مولکولی است که از پروب‌های DNA نشان‌دار شده با فلورسانس برای اتصال به توالی‌های کروموزومی خاص استفاده می‌کند. این توالی‌ها سپس مستقیماً روی کروموزوم‌ها یا در هسته‌های سلولی زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده می‌شوند. FISH با هدف قرار دادن جایگاه‌های تعریف‌شده به جای اسکن کل ژنوم، حذف‌ها، تکثیرها، بازآرایی‌ها و آنیوپلوئیدی‌های خاص را با حساسیت بالا، از جمله در سلول‌های غیرتقسیم‌شونده (اینترفاز)، شناسایی و مکان‌یابی می‌کند.

Definition

FISH تکنیکی است که در آن یک پروب اسید نوکلئیک نشان‌دار شده به توالی‌های مکمل تثبیت‌شده روی یک آماده‌سازی کروموزومی یا هسته سلولی هیبرید می‌شود و با فلورسانس شناسایی می‌گردد، که امکان شناسایی، شمارش یا مکان‌یابی اهداف ژنومی خاص را فراهم می‌کند.

Scope

این موضوع شامل اصل هیبریداسیون پروب، انواع اصلی پروب‌ها و کاربردهای آن‌ها (پروب‌های جایگاه-خاص، سانترومری و رنگ‌آمیزی کل کروموزوم)، و کاربرد FISH در سلول‌های متافاز و اینترفاز است. این یک مرجع روش‌شناختی است و راهنمایی برای مدیریت بالینی ارائه نمی‌دهد.

Core questions

• چگونه یک پروب نشان‌دار به طور خاص و قابل تشخیص به هدف کروموزومی خود متصل می‌شود؟
• چه چیزی پروب‌های جایگاه-خاص، سانترومری و رنگ‌آمیزی کروموزوم را از یکدیگر متمایز می‌کند؟
• چرا FISH می‌تواند هم در سلول‌های اینترفاز و هم در سلول‌های متافاز به کار رود؟
• FISH چه ناهنجاری‌های هدفمندی را حل می‌کند که باندینگ قادر به حل آن‌ها نیست؟

Key concepts

• هیبریداسیون اسید نوکلئیک
• پروب نشان‌دار شده با فلورسانس
• پروب جایگاه-خاص
• پروب سانترومری (آلفا-ستلایت)
• پروب رنگ‌آمیزی کل کروموزوم
• FISH اینترفاز در مقابل متافاز
• ویژگی پروب و شمارش سیگنال
• تشخیص ریزحذف

Mechanisms

یک پروب DNA مکمل توالی هدف با یک فلوروفور (مستقیماً یا از طریق یک مولکول گزارشگر) نشان‌دار می‌شود. DNA کروموزومی هدف روی اسلاید و پروب برای تبدیل شدن به رشته‌های تک‌رشته‌ای دناتوره می‌شوند و سپس اجازه داده می‌شود تا بازپیچی کنند، به طوری که پروب به توالی مکمل خود در جایگاه هیبرید شود. پس از شستشوی پروب‌های متصل‌نشده، سیگنال متصل‌شده با میکروسکوپ فلورسانس مشاهده می‌شود. طرح‌های مختلف پروب اهداف متفاوتی را دنبال می‌کنند: پروب‌های جایگاه-خاص، افزایش‌ها، کاهش‌ها یا بازآرایی‌ها را در یک ژن یا منطقه تعریف‌شده شناسایی یا تأیید می‌کنند؛ پروب‌های سانترومری، تعداد نسخه‌های یک کروموزوم مشخص را شمارش می‌کنند (شمارش آنیوپلوئیدی)؛ و پروب‌های رنگ‌آمیزی کل کروموزوم، یک کروموزوم کامل را برای شناسایی بازآرایی‌های پیچیده نشان‌دار می‌کنند. از آنجا که هیبریداسیون نیازی به سلول‌های تقسیم‌شونده ندارد، FISH می‌تواند روی هسته‌های اینترفاز انجام شود و تجزیه و تحلیل را به بافت‌ها و نمونه‌هایی گسترش دهد که تهیه آماده‌سازی‌های متافاز در آن‌ها دشوار است.

Clinical relevance

FISH برای تأیید یا رد شرایط خاص ریزحذف و ریزتکثیر، برای شمارش آنیوپلوئیدی‌ها، و برای شناسایی بازآرایی‌های تعریف‌شده مانند آن‌هایی که مشخصه برخی سرطان‌ها هستند، استفاده می‌شود. این تکنیک با افزودن تشخیص هدفمند و با حساسیت بالا، از جمله در سلول‌های اینترفاز، مکمل کاریوتایپینگ است. این مدخل نحوه تولید یافته‌های FISH را توضیح می‌دهد؛ مبنایی برای تصمیم‌گیری‌های تشخیصی یا درمانی فردی نیست.

Evidence & guidelines

یافته‌های FISH در چارچوب سیستم بین‌المللی نام‌گذاری سیتوژنومیک انسانی (ISCN) توصیف می‌شوند، که شامل نمادگذاری برای سیگنال‌های پروب و نتایج هیبریداسیون است.

History

هیبریداسیون درجا ابتدا با پروب‌های رادیواکتیو در اواخر دهه ۱۹۶۰ توسعه یافت. تغییر به تشخیص فلورسانس، که به طور کمی توسط پینکل، استروم و گری در سال ۱۹۸۶ نشان داده شد، روشی سریع‌تر، ایمن‌تر و با قابلیت چندرنگ را فراهم کرد و سیتوژنتیک مولکولی را آغاز نمود. طرح‌های پروب بعدی و رویکردهای چندرنگ، FISH را از تشخیص تک‌جایگاه به سمت تجزیه و تحلیل همزمان بسیاری از اهداف گسترش دادند و سیتوژنتیک کلاسیک و ژنتیک مولکولی را به هم پیوند دادند.

Key figures

• Daniel Pinkel
• Joe W. Gray
• Michael Speicher
• Nigel Carter

Seminal works

• pinkel-1986
• speicher-carter-2005

Frequently asked questions

FISH چه تفاوتی با کاریوتایپینگ دارد؟

کاریوتایپینگ کل ژنوم را با وضوح پایین اسکن می‌کند و بازآرایی‌های متعادل و پلوئیدی را نشان می‌دهد، در حالی که FISH از پروب‌های نشان‌دار برای بررسی جایگاه‌های خاص با حساسیت بالا، از جمله در سلول‌های اینترفاز غیرتقسیم‌شونده، استفاده می‌کند. این‌ها رویکردهای مکمل یکدیگر هستند.

آیا FISH را می‌توان بدون سلول‌های تقسیم‌شونده انجام داد؟

بله. از آنجا که هیبریداسیون به تراکم کروموزوم‌ها وابسته نیست، FISH را می‌توان روی هسته‌های اینترفاز اعمال کرد و امکان تجزیه و تحلیل نمونه‌هایی را فراهم می‌کند که از آن‌ها نمی‌توان به راحتی کروموزوم‌های متافاز را به دست آورد.