میکروسکوپ کانفوکال و فلورسانس

میکروسکوپ فلورسانس با تحریک مولکول‌های فلورسنت و جمع‌آوری نور با طول موج بلندتری که از خود ساطع می‌کنند، از نمونه‌ها تصویربرداری می‌کند و تصاویر با کنتراست بالا و اختصاصی مولکولی از سلول‌ها ارائه می‌دهد. میکروسکوپ کانفوکال یک سوراخ سوزنی (pinhole) اضافه می‌کند که نور خارج از فوکوس را حذف می‌کند و برش‌های نوری واضحی تولید می‌کند که می‌توانند برای ایجاد نماهای سه‌بعدی از سلول مونتاژ شوند.

Definition

میکروسکوپ فلورسانس از جذب و بازتاب نور توسط فلوروفورها برای تصویربرداری از ساختارهای نشان‌گذاری شده استفاده می‌کند؛ میکروسکوپ کانفوکال یک تکنیک فلورسانس است که در آن یک سوراخ سوزنی (pinhole) نور خارج از فوکوس را حذف می‌کند تا تنها یک صفحه نازک در فوکوس به هر تصویر کمک کند و برش‌های نوری را به دست آورد.

Scope

این مدخل به اصول کنتراست فلورسانس، مزیت برش‌برداری نوری تصویربرداری کانفوکال، و طیف وسیعی از روش‌های فوق‌تفکیک (super-resolution) که تصویربرداری فلورسانس را به زیر حد پراش می‌رسانند، می‌پردازد. این موارد به عنوان روش‌های تصویربرداری در زیست‌شناسی سلولی مورد بررسی قرار می‌گیرند و نه به عنوان دستورالعمل بالینی.

Core questions

• فلورسانس چگونه کنتراست مولکولی را در یک سلول فراهم می‌کند؟
• یک سوراخ سوزنی (pinhole) کانفوکال چگونه برش‌های نوری تولید می‌کند؟
• تصاویر سه‌بعدی سلول‌ها چگونه بازسازی می‌شوند؟
• روش‌های فوق‌تفکیک چگونه از حد پراش فراتر می‌روند؟

Key concepts

• تحریک و انتشار فلورسانس
• فلوروفورها و پروتئین‌های فلورسنت
• سوراخ سوزنی (pinhole) کانفوکال و برش‌برداری نوری
• بازسازی سه‌بعدی
• فتوبلیچینگ و فوتوتوکسیسیته
• تصویربرداری فوق‌تفکیک (بدون محدودیت پراش)

Mechanisms

در میکروسکوپ فلورسانس، یک فلوروفور نور تحریک را جذب کرده و آن را در طول موج بلندتری بازتاب می‌کند، که توسط فیلترها از نور تحریک جدا می‌شود تا کنتراست روشن و اختصاصی در برابر پس‌زمینه تاریک ایجاد کند، همانطور که توسط لیختمن و کونچلو بررسی شده است. با این حال، یک تصویر فلورسانس معمولی حاوی نور محوکننده از بالا و پایین صفحه کانونی است؛ میکروسکوپ کانفوکال یک سوراخ سوزنی (pinhole) را در نقطه کانونی قرار می‌دهد تا نور خارج از فوکوس حذف شود و برش‌های نوری توصیف شده توسط کونچلو و لیختمن را تولید کند که می‌توانند به صورت سه‌بعدی روی هم چیده شوند. از آنجا که انتشار، مانند تمام میکروسکوپ‌های نوری، همچنان تابع حد پراش است، رویکردهای فوق‌تفکیک (super-resolution) مانند میکروسکوپ تخلیه انتشار تحریک‌شده (stimulated-emission-depletion microscopy)، که توسط هل و ویچمن معرفی شد، فرآیند فلورسانس را دستکاری می‌کنند تا جزئیات را بسیار پایین‌تر از آن حد تفکیک کنند، همانطور که توسط شرمله و همکاران بررسی شده است.

Clinical relevance

میکروسکوپ کانفوکال و فلورسانس به طور گسترده‌ای در پاتولوژی، چشم‌پزشکی و تحقیقات زیست‌پزشکی برای مکان‌یابی مولکول‌ها و تصویربرداری سه‌بعدی از بافت استفاده می‌شوند. این مدخل اصول تصویربرداری مربوطه را توضیح می‌دهد و جنبه آموزشی-مرجع دارد، نه مبنایی برای تصمیم‌گیری‌های تشخیصی یا درمانی فردی.

History

اصل کانفوکال توسط ماروین مینسکای در دهه 1950 ابداع شد، اما میکروسکوپ‌های کانفوکال اسکن لیزری عملی و فلوروفورهای مصنوعی و ژنتیکی کدگذاری شده روشن، تصویربرداری فلورسانس را از اواخر قرن بیستم در زیست‌شناسی سلولی غالب کردند. شکستن متعاقب حد پراش توسط میکروسکوپ تخلیه انتشار تحریک‌شده (Hell & Wichmann, 1994) و تکنیک‌های مرتبط، عصر تصویربرداری فلورسانس فوق‌تفکیک را که توسط شرمله و همکاران خلاصه شده است، آغاز کرد.

Key figures

• Jeff Lichtman
• Jose-Angel Conchello
• Stefan Hell
• Marvin Minsky

Seminal works

• lichtman-2005
• conchello-2005
• hell-1994
• schermelleh-2010

Frequently asked questions

سوراخ سوزنی (pinhole) کانفوکال چه کاری انجام می‌دهد؟

این سوراخ به گونه‌ای قرار می‌گیرد که نور خارج از صفحه کانونی مسدود شود و تنها نور در فوکوس برای تشکیل تصویر باقی بماند؛ این امر یک برش نوری نازک تولید می‌کند که می‌تواند با برش‌های دیگر ترکیب شده و یک نمای سه‌بعدی را ایجاد کند.

میکروسکوپ فلورسانس چگونه می‌تواند حد پراش را شکست دهد؟

روش‌های فوق‌تفکیک مانند میکروسکوپ تخلیه انتشار تحریک‌شده، فرآیند انتشار فلورسانس را کنترل می‌کنند تا جزئیات بسیار پایین‌تر از حد پراش کلاسیک قابل تفکیک باشند.