PCR und Nukleinsäureamplifikation

Die Polymerase-Kettenreaktion – eine zyklische, Primer-gesteuerte Methode, die ein ausgewähltes DNA-Segment exponentiell kopiert – und die breitere Familie der darauf aufbauenden Amplifikationstechniken.

Definition

Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine In-vitro-Methode, die eine definierte DNA-Region exponentiell durch wiederholte Zyklen der Strangtrennung, des Annealings flankierender Primer und der Extension durch eine thermostabile DNA-Polymerase amplifiziert; die Nukleinsäureamplifikation umfasst im weiteren Sinne verwandte Techniken zum Kopieren von DNA- oder RNA-Sequenzen.

Scope

Dieses Thema behandelt die Prinzipien und Varianten der Nukleinsäureamplifikation: die thermische Zyklisierung von Denaturierung, Primer-Annealing und Extension, die die Polymerase-Kettenreaktion definiert; die Rolle von Primern und thermostabiler Polymerase; und Erweiterungen wie die Reverse-Transkription und die quantitative Echtzeit-Amplifikation. Es behandelt die Methode und ihre Logik; Sequenzierung und Klonierung, die amplifizierte DNA verwenden, werden in begleitenden Themen behandelt.

Core questions

• Wie amplifizieren wiederholte Zyklen von Erhitzen und Abkühlen eine spezifische DNA-Region?
• Warum sind zwei Primer und eine thermostabile Polymerase unerlässlich?
• Wie wird die Amplifikation exponentiell?
• Wie wird die Methode erweitert, um Nukleinsäuren zu quantifizieren oder RNA zu amplifizieren?

Key theories

Primer-definierte exponentielle Amplifikation

Ein Paar von Primern, die das Ziel flankieren, definiert die amplifizierte Region, und da jeder neue Strang im nächsten Zyklus als Matrize dient, verdoppelt sich die Anzahl der Zielkopien pro Zyklus annähernd und wächst exponentiell.

Thermostabile Polymerase ermöglicht Zyklisierung

Die Verwendung einer hitzestabilen DNA-Polymerase ermöglicht wiederholte Hochtemperatur-Denaturierung ohne erneute Zugabe von Enzym, was die automatisierte thermische Zyklisierung praktisch und die Reaktion robust macht.

Mechanisms

Jeder Zyklus erhitzt die Probe, um die DNA-Stränge zu trennen, kühlt sie ab, sodass zwei Primer an Sequenzen, die das Ziel auf gegenüberliegenden Strängen flankieren, anlagern, und erwärmt sie auf eine Extensionstemperatur, bei der eine thermostabile Polymerase neue Stränge von den Primern synthetisiert. Da die Produkte eines Zyklus als Matrize für den nächsten dienen, wird die Zielregion über viele Zyklen exponentiell amplifiziert. Varianten umfassen die Reverse-Transkriptions-Amplifikation, die zuerst RNA in DNA kopiert, und die quantitative Echtzeit-Amplifikation, die die Produktakkumulation überwacht, um die Ausgangsmengen zu messen.

Clinical relevance

Die Amplifikation ist zentral für Gentests, den Nachweis von Krankheitserregern und die forensische Identifizierung; dargestellt als Bedeutung und nicht als klinische Leitlinie.

History

Mullis konzipierte die Polymerase-Kettenreaktion in den frühen 1980er Jahren, und der Bericht von Saiki und Kollegen aus dem Jahr 1985 demonstrierte ihre Anwendung, wobei die spätere Einführung der thermostabilen Polymerase sie routinemäßig machte; die Erfindung wurde 1993 mit dem Nobelpreis für Chemie gewürdigt.

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki1985
• lodish2016

Frequently asked questions

Warum benötigt die PCR Primer?

Primer definieren die Startpunkte der Synthese auf jedem Strang, bestimmen also, welche Region kopiert wird, und ermöglichen der Polymerase den Beginn der Extension.

Was macht die Amplifikation exponentiell?

Die neuen Stränge jedes Zyklus werden in den nächsten Zyklen zu Matrizen, sodass sich die Anzahl der Kopien des Ziels in jedem Zyklus annähernd verdoppelt.