Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine molekularzytogenetische Technik, die fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden verwendet, um spezifische chromosomale Sequenzen zu binden, die dann direkt auf Chromosomen oder in Zellkernen unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Durch die gezielte Untersuchung definierter Loci anstatt des gesamten Genoms detektiert und lokalisiert FISH spezifische Deletionen, Duplikationen, Rearrangements und Aneuploidien mit hoher Sensitivität, auch in nicht-teilenden (Interphase-)Zellen.

Definition

FISH ist eine Technik, bei der eine markierte Nukleinsäure-Sonde an komplementäre Sequenzen hybridisiert wird, die auf einem Chromosomenpräparat oder Zellkern fixiert sind, und durch Fluoreszenz detektiert wird, wodurch spezifische genomische Ziele identifiziert, gezählt oder lokalisiert werden können.

Scope

Dieses Thema behandelt das Prinzip der Sondenhybridisierung, die wichtigsten Sondentypen und ihre Anwendungen (locus-spezifische, zentromere und Ganzchromosomen-Paint-Sonden) sowie die Anwendung von FISH auf Metaphase- und Interphasezellen. Es handelt sich um eine methodische Referenz und bietet keine Anleitung zur klinischen Behandlung.

Core questions

• Wie erreicht eine markierte Sonde eine spezifische, nachweisbare Bindung an ihr chromosomales Ziel?
• Was unterscheidet locus-spezifische, zentromere und Chromosomen-Paint-Sonden?
• Warum kann FISH sowohl auf Interphase- als auch auf Metaphasezellen angewendet werden?
• Welche gezielten Anomalien löst FISH auf, die die Bandenanalyse nicht auflösen kann?

Key concepts

• Nukleinsäurehybridisierung
• Fluoreszenzmarkierte Sonde
• Locus-spezifische Sonde
• Zentromere (Alpha-Satelliten-)Sonde
• Ganzchromosomen-Paint-Sonde
• Interphase- versus Metaphase-FISH
• Sondenspezifität und Signalzählung
• Mikrodeletionsdetektion

Mechanisms

Eine DNA-Sonde, die komplementär zu einer Zielsequenz ist, wird mit einem Fluorophor markiert (direkt oder über ein Reportermolekül). Die chromosomale Ziel-DNA auf einem Objektträger und die Sonde werden zu Einzelsträngen denaturiert und anschließend rekombiniert, sodass die Sonde an ihre komplementäre Sequenz an Ort und Stelle hybridisiert. Nach dem Abwaschen ungebundener Sonden wird das gebundene Signal mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Verschiedene Sondendesigns dienen unterschiedlichen Zwecken: Locus-spezifische Sonden detektieren oder bestätigen Zugewinne, Verluste oder Rearrangements an einem definierten Gen oder einer Region; zentromere Sonden zählen Kopien eines bestimmten Chromosoms (Enumeration von Aneuploidie); und Ganzchromosomen-Paint-Sonden markieren ein gesamtes Chromosom, um komplexe Rearrangements zu charakterisieren. Da die Hybridisierung keine teilenden Zellen erfordert, kann FISH an Interphasekernen durchgeführt werden, wodurch die Analyse auf Gewebe und Proben ausgedehnt wird, bei denen Metaphasepräparate schwer zu erhalten sind.

Clinical relevance

FISH wird verwendet, um spezifische Mikrodeletions- und Mikroreduplikationssyndrome zu bestätigen oder auszuschließen, Aneuploidien zu enumerieren und definierte Rearrangements zu detektieren, wie sie bestimmte Krebserkrankungen charakterisieren. Es ergänzt die Karyotypisierung durch gezielte, hochsensitive Detektion, auch in Interphasezellen. Dieser Eintrag beschreibt, wie FISH-Befunde generiert werden; er ist keine Grundlage für individuelle diagnostische oder therapeutische Entscheidungen.

Evidence & guidelines

FISH-Befunde werden im Rahmen des International System for Human Cytogenomic Nomenclature (ISCN) beschrieben, das eine Notation für Sondensignale und Hybridisierungsergebnisse umfasst.

History

Die In-situ-Hybridisierung wurde erstmals in den späten 1960er Jahren mit radioaktiven Sonden entwickelt. Die Umstellung auf die fluoreszierende Detektion, die 1986 von Pinkel, Straume und Gray quantitativ demonstriert wurde, führte zu einer schnelleren, sichereren und mehrfarbigen Methode und begründete die molekulare Zytogenetik. Nachfolgende Sondendesigns und Mehrfarbenansätze erweiterten FISH von der Einzel-Locus-Detektion hin zur simultanen Analyse vieler Ziele und schlugen eine Brücke zwischen klassischer Zytogenetik und Molekulargenetik.

Key figures

• Daniel Pinkel
• Joe W. Gray
• Michael Speicher
• Nigel Carter

Seminal works

• pinkel-1986
• speicher-carter-2005

Frequently asked questions

Wie unterscheidet sich FISH von der Karyotypisierung?

Die Karyotypisierung scannt das gesamte Genom mit geringer Auflösung und deckt balancierte Rearrangements und Ploidie auf, während FISH markierte Sonden verwendet, um spezifische Loci mit hoher Sensitivität zu untersuchen, auch in nicht-teilenden Interphasezellen. Es handelt sich um komplementäre Ansätze.

Kann FISH ohne teilende Zellen durchgeführt werden?

Ja. Da die Hybridisierung nicht von der Chromosomenkondensation abhängt, kann FISH auf Interphasekerne angewendet werden, was die Analyse von Proben ermöglicht, aus denen Metaphasechromosomen nicht leicht gewonnen werden können.