Konfokale und Fluoreszenzmikroskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie bildet Proben ab, indem sie fluoreszierende Moleküle anregt und das von ihnen emittierte Licht längerer Wellenlänge sammelt, wodurch hochkontrastreiche, molekularspezifische Bilder von Zellen entstehen. Die konfokale Mikroskopie fügt ein Pinhole hinzu, das außerfokales Licht abweist und scharfe optische Schnitte erzeugt, die zu dreidimensionalen Ansichten der Zelle zusammengesetzt werden können.

Definition

Die Fluoreszenzmikroskopie nutzt die Absorption und Re-Emission von Licht durch Fluorophore, um markierte Strukturen abzubilden; die konfokale Mikroskopie ist eine Fluoreszenztechnik, bei der ein Pinhole außerfokales Licht ausschließt, sodass nur eine dünne, im Fokus liegende Ebene zu jedem Bild beiträgt, was optische Schnitte liefert.

Scope

Der Eintrag behandelt das Prinzip des Fluoreszenzkontrasts, den Vorteil der optischen Schnittbildung bei der konfokalen Bildgebung und die breite Klasse der Superauflösungsmethoden, die die Fluoreszenzbildgebung unter die Beugungsgrenze verschieben. Diese werden als Bildgebungsmethoden innerhalb der Zellbiologie und nicht als klinische Anweisung behandelt.

Core questions

• Wie erzeugt Fluoreszenz molekularen Kontrast in einer Zelle?
• Wie erzeugt ein konfokales Pinhole optische Schnitte?
• Wie werden dreidimensionale Bilder von Zellen rekonstruiert?
• Wie überschreiten Superauflösungsmethoden die Beugungsgrenze?

Key concepts

• Fluoreszenzanregung und -emission
• Fluorophore und fluoreszierende Proteine
• Konfokales Pinhole und optische Schnittbildung
• Dreidimensionale Rekonstruktion
• Photobleaching und Phototoxizität
• Superauflösende (beugungsbegrenzte) Bildgebung

Mechanisms

In der Fluoreszenzmikroskopie absorbiert ein Fluorophor Anregungslicht und emittiert bei einer längeren Wellenlänge, die durch Filter vom Anregungslicht getrennt wird, um einen hellen, spezifischen Kontrast vor einem dunklen Hintergrund zu erzeugen, wie von Lichtman und Conchello beschrieben. Ein konventionelles Fluoreszenzbild enthält jedoch unscharfes Licht von oberhalb und unterhalb der Fokusebene; die konfokale Mikroskopie platziert ein Pinhole konjugiert zum Brennpunkt, sodass außerfokales Licht abgewiesen wird, wodurch die von Conchello und Lichtman beschriebenen optischen Schnitte entstehen, die zu dreidimensionalen Ansichten gestapelt werden können. Da die Emission, wie bei der gesamten Lichtmikroskopie, immer noch der Beugungsgrenze unterliegt, manipulieren Superauflösungsansätze wie die STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion Microscopy), eingeführt von Hell und Wichmann, den Fluoreszenzprozess selbst, um Details weit unterhalb dieser Grenze aufzulösen, wie von Schermelleh und Kollegen zusammengefasst.

Clinical relevance

Konfokale und Fluoreszenzmikroskopie werden in der Pathologie, Ophthalmologie und biomedizinischen Forschung weit verbreitet eingesetzt, um Moleküle zu lokalisieren und Gewebe dreidimensional abzubilden. Dieser Eintrag erläutert die beteiligten Bildgebungsprinzipien und dient der Referenzbildung, nicht als Grundlage für individuelle diagnostische oder Behandlungsentscheidungen.

History

Das konfokale Prinzip wurde in den 1950er Jahren von Marvin Minsky konzipiert, aber praktische laserabtastende Konfokalmikroskope und helle synthetische sowie genetisch kodierte Fluorophore machten die Fluoreszenzbildgebung ab dem späten 20. Jahrhundert in der Zellbiologie dominant. Das anschließende Überschreiten der Beugungsgrenze durch die STED-Mikroskopie (Hell & Wichmann, 1994) und verwandte Techniken eröffnete die Ära der Superauflösungs-Fluoreszenzbildgebung, die von Schermelleh und Kollegen zusammengefasst wurde.

Key figures

• Jeff Lichtman
• Jose-Angel Conchello
• Stefan Hell
• Marvin Minsky

Seminal works

• lichtman-2005
• conchello-2005
• hell-1994
• schermelleh-2010

Frequently asked questions

Was bewirkt das konfokale Pinhole?

Es ist so positioniert, dass Licht von außerhalb der Fokusebene blockiert wird, sodass nur im Fokus liegendes Licht das Bild bildet; dies erzeugt einen dünnen optischen Schnitt, der mit anderen zu einer dreidimensionalen Ansicht kombiniert werden kann.

Wie kann die Fluoreszenzmikroskopie die Beugungsgrenze überwinden?

Superauflösungsmethoden wie die STED-Mikroskopie steuern den Fluoreszenzemissionsprozess so, dass Details weit unterhalb der klassischen Beugungsgrenze aufgelöst werden können.