İmmünohistokimya ve İmmünofloresans
İmmünohistokimya (İHK) ve immünofloresans, bir doku kesiti içindeki spesifik molekülleri saptamak amacıyla antikorları kullanmaktadır. Bir antikor, hedef antijenine in situ bağlanmakta ve ardından görünür hale getirilmektedir — bu, renkli bir ürün bırakan bir enzim (İHK) veya bir floresan mikroskobu altında görülen floresan bir etiket (immünofloresans) aracılığıyla gerçekleştirilmektedir — böylece rutin boyamaların ayırt edemediği hücre tiplerinin ve moleküllerin tanımlanmasına olanak sağlanmaktadır.
Tanım
İmmünohistokimya ve immünofloresans, işaretli antikorları hedeflerine bağlayarak ve bağlanan etiketi enzimatik renk reaksiyonları (immünohistokimya) veya floresans (immünofloresans) aracılığıyla saptayarak doku kesitlerindeki spesifik antijenleri lokalize eden antikor tabanlı yöntemlerdir.
Kapsam
Bu konu, antikor tabanlı işaretleme prensibini, doğrudan ve dolaylı saptama yöntemlerini, sinyal amplifikasyon sistemlerini, antijen geri kazanımını ve bu testlerin validasyonunu ve kalite kontrolünü kapsamaktadır. Bu, metodolojik bir referans olup klinik yorum veya tedavi rehberliği sağlamamaktadır.
Temel sorular
- Bir antikor, dokuda moleküle özgü lokalizasyonu nasıl sağlamaktadır?
- Doğrudan ve dolaylı saptama şemaları nasıl farklılık göstermektedir?
- Amplifikasyon sistemleri ve antijen geri kazanımı hassasiyeti nasıl artırmaktadır?
- Antikor tabanlı testler, güvenilir yorumlama için nasıl valide edilmekte ve kontrol edilmektedir?
Anahtar kavramlar
- Antijen-antikor bağlanma özgüllüğü
- Doğrudan ve dolaylı saptama
- Sinyal amplifikasyonu (örn. avidin-biyotin, polimer sistemleri)
- Kromojenik ve floresan etiketler
- Antijen (epitop) geri kazanımı
- Kontroller ve test validasyonu
- Özgüllük ve çapraz reaktivite
Mekanizmalar
Temel olay, bir antikorun kesit içindeki antijenine spesifik olarak bağlanmasıdır. Doğrudan yöntemde, birincil antikorun kendisi etiketi taşımaktadır; dolaylı yöntemde ise etiketsiz birincil antikor, hem saptamayı güçlendiren hem de standartlaştıran işaretli ikincil bir antikor tarafından saptanmaktadır. Coons ve arkadaşları, floresan bir grupla etiketlenmiş bir antikorun antijenini dokuda lokalize edebileceğini ilk kez göstermiş (Coons, 1941) ve immünofloresansı kurmuşlardır. Enzim tabanlı saptama daha sonra kalıcı kromojenik sinyallere olanak sağlamış ve avidin-biyotin-peroksidaz kompleksi (Hsu ve ark., 1981) gibi amplifikasyon sistemleri ve daha sonra polimer tabanlı saptama ile hassasiyet artırılmıştır. Aldehit fiksasyonu, çapraz bağlama yoluyla epitopları maskeleyebildiğinden, formalinle fikse edilmiş parafine gömülü dokuda antikor bağlanmasını geri kazandırmak için sıklıkla ısı veya proteaz tabanlı antijen geri kazanım adımları kullanılmaktadır (Shi ve ark., 1991). Güvenilir yorumlama, uygun pozitif ve negatif kontrollere ve her testin resmi analitik validasyonuna bağlıdır (Fitzgibbons ve ark., 2014).
Klinik önem
Antikor tabanlı işaretleme, hücre soyunu ve spesifik moleküler belirteçleri tanımlayarak modern doku tabanlı tanı ve araştırmaların çoğunun temelini oluşturmaktadır. Bu madde, yöntemleri ve kalite gereksinimlerini kavramsal olarak açıklamaktadır; bireysel tanı veya tedavi kararları için bir temel değil, bir referans yönlendirmedir.
Kanıt ve kılavuzlar
İmmünohistokimyasal testlerin analitik validasyonuna ilişkin profesyonel rehberlik, College of American Pathologists (Fitzgibbons ve ark., 2014) tarafından yayımlanmıştır ve yöntem prensipleri standart histoteknoloji referanslarında (Suvarna ve ark., 2018) pekiştirilmektedir. Antijen geri kazanım ve amplifikasyon yöntemleri, temel birincil çalışmalardan (Shi ve ark., 1991; Hsu ve ark., 1981) türemektedir.
Tarihçe
Antikor tabanlı lokalizasyon, Coons ve arkadaşlarının 1941'deki floresan antikor yöntemiyle başlamış ve dokuda moleküle özgü saptamayı mümkün kılmıştır. Enzim etiketli yöntemler daha sonra kalıcı görünür sinyaller sağlamış, avidin-biyotin-peroksidaz kompleksi (Hsu ve ark., 1981) gibi amplifikasyon sistemleri hassasiyeti artırmış ve ısıya bağlı antijen geri kazanımı (Shi ve ark., 1991) güvenilir immün boyamayı rutin olarak fikse edilmiş, parafine gömülü materyallere kadar genişletmiştir. Yöntemler tanı pratiğinin merkezine oturdukça standardizasyon ve validasyon rehberliği de bunu takip etmiştir (Fitzgibbons ve ark., 2014).
Öne çıkan isimler
- Albert Coons
- Su-Ming Hsu
- Shan-Rong Shi
İlgili konular
Temel eserler
- coons-1941
- hsu-1981
- shi-1991
Sıkça sorulan sorular
- İmmünohistokimya ve immünofloresans arasındaki fark nedir?
- Her ikisi de antijenleri dokuda lokalize etmek için antikorları kullanmaktadır; immünohistokimya, ışık mikroskobuyla görülen renkli bir ürün bırakan bir enzim aracılığıyla bağlanan antikoru görselleştirirken, immünofloresans bir floresan mikroskobu altında görülen floresan bir etiket kullanmaktadır.
- Antijen geri kazanımına neden sıklıkla ihtiyaç duyulmaktadır?
- Formalin fiksasyonu proteinleri çapraz bağlar ve antikorların tanıdığı epitopları maskeleyebilir; ısı veya enzim tabanlı antijen geri kazanım adımları bu epitopları açığa çıkararak formalinle fikse edilmiş, parafine gömülü dokuda boyamanın mümkün olmasını sağlayabilmektedir.