Методы микроскопии и окрашивания грибов

Прямая микроскопия и окрашивание позволяют лабораторно выявлять элементы грибов в образце, не дожидаясь результатов культурального исследования. Простые влажные препараты, флуоресцентные отбеливатели и гистологические красители выявляют гифы, дрожжи и споры, обеспечивая быстрое подтверждение присутствия грибов, а в тканях — их инвазии.

Definition

Методы микроскопии и окрашивания грибов — это методики, которые делают структуры грибов видимыми в клинических образцах или срезах тканей, используя осветляющие агенты, флуоресцентные связующие вещества клеточных стенок или гистохимические красители для демонстрации гиф, дрожжей и спор под световым или флуоресцентным микроскопом.

Scope

Эта тема охватывает методы визуализации грибов: влажные препараты с гидроксидом калия, которые осветляют образцы, флуоресцентные красители, такие как кальцифлюор белый, связывающиеся с клеточными стенками грибов, и гистопатологические красители, используемые для срезов тканей. Также рассматривается, что морфология может и не может сообщить наблюдателю об идентичности. Это описательный справочник по методам, а не диагностический или лечебный протокол.

Core questions

• Присутствуют ли грибковые элементы в этом образце, и какую морфологическую форму они принимают?
• Какой краситель лучше всего демонстрирует грибы во влажном препарате по сравнению со срезом ткани?
• Насколько морфология сама по себе может сузить идентификацию гриба?
• Показывает ли микроскопия инвазию тканей в отличие от поверхностной колонизации?

Key concepts

• Влажный препарат с гидроксидом калия (KOH)
• Флуоресцентный краситель кальцифлюор белый
• ШИК-реакция (PAS)
• Окрашивание метенамин-серебром по Грокотту-Гомори (GMS)
• Гифы, дрожжи и псевдогифы
• Инвазия тканей против колонизации
• Пределы морфологической идентификации

Mechanisms

В препарате KOH гидроксид калия растворяет кератин и другие материалы хозяина, оставляя видимыми под микроскопом преломляющие свет стенки грибов. Флуоресцентные отбеливатели, такие как кальцифлюор белый, связываются с хитином и целлюлозой в клеточной стенке грибов и флуоресцируют под ультрафиолетовым светом, четко очерчивая гифы и дрожжи на темном фоне. В тканях специальные красители используют богатую полисахаридами стенку: ШИК-реакция (periodic acid-Schiff) окрашивает стенки грибов в пурпурный цвет, а метенамин-серебро по Грокотту-Гомори (Grocott-Gomori methenamine silver) осаждает серебро, делая их черными, что позволяет видеть грибы внутри срезов и, что крайне важно, оценивать их как инвазирующие ткань. Морфология, характер ветвления гиф, наличие дрожжей или псевдогиф и септация сужают круг дифференциальной диагностики, но редко являются специфичными для вида, поэтому микроскопия сочетается с культуральными, антигенными или молекулярными методами для окончательной идентификации.

Clinical relevance

Микроскопия предоставляет одни из самых быстрых доказательств присутствия гриба и, в тканях, его инвазии, что является центральным моментом в распознавании инвазивных грибковых заболеваний. Эта статья объясняет методы и их интерпретационные ограничения в качестве справочного материала; она не содержит инструкций по подготовке образцов или ведению пациентов.

Evidence & guidelines

Обзоры гистопатологии грибов документируют красители, используемые для выявления грибов в тканях, а также морфологические признаки и ограничения идентификации организмов по внешнему виду. Рекомендации по передовой практике диагностики серьезных грибковых заболеваний позиционируют прямую микроскопию и флуоресцентное окрашивание как быстрые методы первой линии, используемые в сочетании с культуральными и молекулярными тестами.

History

Прямая микроскопия является одним из старейших микологических методов, при этом влажные препараты KOH давно используются для демонстрации дерматофитов и других грибов. Гистохимические красители, такие как метенамин-серебро по Грокотту-Гомори и ШИК-реакция, стали стандартом в двадцатом веке для выявления грибов в тканях, а флуоресцентные отбеливатели позже повысили чувствительность, заставляя клеточные стенки светиться под ультрафиолетовым светом.

Seminal works

• guarner-2011
• dehoog-2020

Frequently asked questions

Может ли микроскопия идентифицировать точный вид гриба?

Обычно нет. Микроскопия может показать присутствие грибов и предложить широкие категории, такие как дрожжи или плесень, но точная идентификация вида обычно требует культурального исследования, масс-спектрометрии или секвенирования ДНК.

Почему кальцифлюор белый полезен для выявления грибов?

Кальцифлюор белый связывается с компонентами клеточной стенки грибов и флуоресцирует под ультрафиолетовым светом, делая даже редкие гифы и дрожжи ярко выраженными, что улучшает обнаружение по сравнению с неокрашенным влажным препаратом.