Pengurutan DNA

Bagaimana urutan basa dalam DNA ditentukan — dari metode penghentian rantai Sanger hingga teknologi paralel masif yang membaca seluruh genom.

Definition

Pengurutan DNA adalah penentuan urutan nukleotida yang tepat dalam molekul DNA, yang secara historis dicapai dengan sintesis penghentian rantai dan sekarang didominasi oleh metode paralel masif yang membaca banyak fragmen secara bersamaan.

Scope

Topik ini mencakup metode untuk membaca urutan nukleotida DNA: metode penghentian rantai (Sanger) dan prinsip penghentian spesifik basa, serta pendekatan paralel masif ber throughput tinggi yang menggantikannya dan membuat pengurutan skala genom menjadi rutin. Ini membahas logika pengurutan; amplifikasi dan kloning yang mempersiapkan DNA untuk pengurutan dibahas dalam topik pendamping.

Core questions

• Bagaimana pengurutan penghentian rantai mengungkapkan urutan basa?
• Mengapa dideoksinukleotida berlabel membuat pengurutan menjadi praktis?
• Bagaimana metode paralel masif menskalakan pengurutan ke seluruh genom?
• Bagaimana pembacaan pendek dirakit menjadi urutan dan genom yang lebih panjang?

Key theories

Pengurutan penghentian rantai

Sintesis dengan adanya dideoksinukleotida penghenti rantai menghasilkan serangkaian fragmen yang berakhir pada setiap kemunculan basa tertentu, dan mengurutkannya berdasarkan panjang mengungkapkan urutannya, seperti yang diperkenalkan oleh Sanger dan rekan-rekannya.

Pengurutan paralel masif

Membaca sejumlah besar fragmen DNA sekaligus dan merekonstruksi urutan secara komputasi menurunkan biaya dan meningkatkan throughput secara dramatis, memungkinkan pengurutan skala genom secara rutin.

Mechanisms

Dalam pengurutan penghentian rantai, sebuah primer diperpanjang di sepanjang templat dengan adanya nukleotida normal ditambah sebagian kecil dideoksinukleotida yang, setelah dimasukkan, menghentikan sintesis; hasilnya adalah serangkaian fragmen bersarang yang basa terminalnya diketahui, yang dipisahkan berdasarkan ukuran untuk membaca urutan. Platform paralel masif modern mengimobilisasi dan mengamplifikasi banyak fragmen templat dan mendeteksi penggabungan basa di seluruh fragmen tersebut secara bersamaan, menghasilkan sejumlah besar pembacaan pendek yang perangkat lunak menyelaraskan atau merakit menjadi urutan lengkap.

Clinical relevance

Pengurutan mendasari diagnosis genetik, genomik kanker, pengawasan patogen, dan pendekatan personalisasi dalam kedokteran; disajikan sebagai signifikansi, bukan panduan klinis.

History

Metode penghentian rantai Sanger dan metode kimia Maxam–Gilbert yang paralel, keduanya dari tahun 1970-an, membuat pengurutan DNA menjadi mungkin dan mendapatkan pengakuan Nobel; munculnya teknologi paralel masif pada tahun 2000-an mengurangi biaya secara signifikan dan mengantarkan era genomik.

Key figures

• Frederick Sanger
• Walter Gilbert

Seminal works

• sanger1977
• lodish2016

Frequently asked questions

Apa itu dideoksinukleotida dan mengapa digunakan dalam pengurutan?

Ini adalah nukleotida yang dimodifikasi yang, setelah ditambahkan, menghentikan sintesis lebih lanjut; memasukkannya pada posisi acak menghasilkan fragmen yang berakhir pada setiap basa, yang mengungkapkan urutan.

Bagaimana seluruh genom dapat diurutkan begitu cepat sekarang?

Platform paralel masif membaca jutaan fragmen DNA sekaligus dan menggunakan perangkat lunak untuk merakitnya, sangat meningkatkan kecepatan dan menurunkan biaya dibandingkan dengan metode sebelumnya.