CRISPR dan Penyuntingan Genom

Bagaimana nuklease terprogram, khususnya sistem CRISPR–Cas yang dipandu RNA, membuat potongan target pada DNA yang memungkinkan peneliti menyunting genom dengan kemudahan yang belum pernah ada sebelumnya.

Definition

Penyuntingan genom adalah perubahan target DNA suatu organisme pada situs yang dipilih menggunakan nuklease terprogram; CRISPR–Cas adalah sistem yang dipandu RNA, berasal dari imunitas bakteri, di mana RNA pemandu mengarahkan nuklease Cas ke urutan DNA yang cocok untuk membuat putus untai ganda untuk penyuntingan.

Scope

Topik ini mencakup penyuntingan genom bertarget, yang berpusat pada CRISPR–Cas. Ini membahas asal-usul bakteri CRISPR sebagai sistem kekebalan adaptif, prinsip pembelahan DNA yang dipandu RNA oleh Cas9, bagaimana kerusakan yang dihasilkan diperbaiki untuk menghapus atau menyisipkan urutan, dan perbandingan singkat dengan nuklease terprogram sebelumnya. Ini membahas metode dan logikanya; metode kloning, amplifikasi, dan pengurutan yang lebih luas dibahas dalam topik pendamping.

Core questions

• Dari mana CRISPR berasal dan apa fungsi alaminya?
• Bagaimana RNA pemandu mengarahkan Cas9 ke urutan DNA tertentu?
• Bagaimana putus untai ganda digunakan untuk menghapus atau menyisipkan urutan?
• Bagaimana CRISPR dibandingkan dengan alat penyuntingan genom sebelumnya?

Key theories

Pembelahan DNA yang dipandu RNA

Jinek dan rekan-rekannya menunjukkan bahwa nuklease Cas9 dapat diprogram oleh RNA pemandu tunggal untuk memotong urutan DNA yang cocok, mengubah sistem kekebalan bakteri menjadi alat penyuntingan yang serbaguna dan mudah ditargetkan.

Penyuntingan yang diarahkan perbaikan

Putus untai ganda yang dibuat pada target diperbaiki oleh jalur sel itu sendiri, sehingga penyambungan ujung yang rawan kesalahan mengganggu gen atau perbaikan yang diarahkan homologi memperkenalkan perubahan yang ditentukan yang disediakan oleh templat.

Mechanisms

Dalam penyuntingan CRISPR–Cas, RNA pemandu berpasangan basa dengan urutan DNA target yang berdekatan dengan motif pengenalan pendek, mengarahkan nuklease Cas untuk memotong kedua untai pada situs tersebut. Sel kemudian memperbaiki kerusakan: penyambungan ujung non-homolog sering kali memperkenalkan insersi atau delesi kecil yang menonaktifkan gen, sementara perbaikan yang diarahkan homologi, dengan templat donor, memasang perubahan urutan yang tepat. Karena spesifisitas diatur hanya oleh urutan RNA pemandu, sistem ini jauh lebih mudah untuk ditargetkan ulang daripada nuklease terprogram protein sebelumnya.

Clinical relevance

Penyuntingan genom sedang dikembangkan untuk terapi gen dan sel dan merupakan alat penelitian standar, sementara penggunaannya pada manusia menimbulkan pertimbangan etis yang signifikan; disajikan sebagai signifikansi daripada panduan klinis.

History

Berdasarkan penemuan bahwa lokus CRISPR membentuk sistem kekebalan adaptif bakteri, demonstrasi tahun 2012 oleh Doudna dan Charpentier bahwa Cas9 dapat diprogram dengan RNA pemandu tunggal membentuk penyuntingan genom CRISPR, yang diakui oleh Hadiah Nobel Kimia 2020.

Debates

Penyuntingan germline manusia

Penyuntingan sel yang dapat diwariskan menimbulkan kekhawatiran etika dan keamanan tentang persetujuan, efek di luar target, dan kesetaraan; komunitas ilmiah telah menyerukan kehati-hatian sementara aplikasi pada sel yang tidak dapat diwariskan terus maju.

Key figures

• Jennifer Doudna
• Emmanuelle Charpentier

Seminal works

• jinek2012
• watson2013

Frequently asked questions

Apa fungsi RNA pemandu dalam CRISPR?

RNA pemandu berpasangan basa dengan urutan DNA yang cocok dan mengarahkan nuklease Cas untuk memotong di sana, sehingga mengubah pemandu akan mengubah target.

Bagaimana pemotongan DNA menghasilkan penyuntingan?

Sel memperbaiki kerusakan; tergantung pada jalur dan templat yang disediakan, ini akan mengganggu gen atau memperkenalkan perubahan yang dimaksudkan secara tepat.