PCR y Amplificación de Ácidos Nucleicos
La reacción en cadena de la polimerasa —un método cíclico, dirigido por cebadores, que copia exponencialmente un segmento de ADN elegido— y la familia más amplia de técnicas de amplificación construidas sobre ella.
Definition
La reacción en cadena de la polimerasa es un método in vitro que amplifica exponencialmente una región definida de ADN mediante ciclos repetidos de separación de cadenas, hibridación de cebadores flanqueantes y extensión por una ADN polimerasa termoestable; la amplificación de ácidos nucleicos abarca más ampliamente técnicas relacionadas para copiar secuencias de ADN o ARN.
Scope
Este tema cubre los principios y variantes de la amplificación de ácidos nucleicos: el ciclo térmico de desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión que define la reacción en cadena de la polimerasa; el papel de los cebadores y la polimerasa termoestable; y extensiones como la transcripción inversa y la amplificación cuantitativa en tiempo real. Trata el método y su lógica; la secuenciación y clonación que utilizan ADN amplificado se cubren en temas complementarios.
Core questions
- ¿Cómo amplifican los ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento una región específica de ADN?
- ¿Por qué son esenciales dos cebadores y una polimerasa termoestable?
- ¿Cómo se vuelve exponencial la amplificación?
- ¿Cómo se extiende el método para cuantificar ácidos nucleicos o para amplificar ARN?
Key theories
- Amplificación exponencial definida por cebadores
- Un par de cebadores que flanquean el objetivo define la región amplificada, y debido a que cada nueva cadena sirve como molde en el siguiente ciclo, el número de copias del objetivo se duplica aproximadamente por ciclo, creciendo exponencialmente.
- La polimerasa termoestable permite el ciclado
- El uso de una ADN polimerasa termoestable permite la desnaturalización repetida a alta temperatura sin necesidad de volver a añadir enzima, lo que hace que el ciclado térmico automatizado sea práctico y la reacción robusta.
Mechanisms
Cada ciclo calienta la muestra para separar las cadenas de ADN, la enfría para que dos cebadores se hibriden a secuencias que flanquean el objetivo en cadenas opuestas, y la calienta a una temperatura de extensión a la que una polimerasa termoestable sintetiza nuevas cadenas a partir de los cebadores. Dado que los productos de un ciclo sirven de molde para el siguiente, la región objetivo se amplifica exponencialmente a lo largo de muchos ciclos. Las variantes incluyen la amplificación por transcripción inversa, que primero copia el ARN en ADN, y la amplificación cuantitativa en tiempo real, que monitorea la acumulación de producto para medir las cantidades iniciales.
Clinical relevance
La amplificación es fundamental para las pruebas genéticas, la detección de patógenos y la identificación forense; se presenta como significado más que como guía clínica.
History
Mullis concibió la reacción en cadena de la polimerasa a principios de la década de 1980, y el informe de 1985 de Saiki y sus colegas demostró su uso, con la posterior adopción de la polimerasa termoestable que la hizo rutinaria; la invención fue reconocida con el Premio Nobel de Química de 1993.
Key figures
- Kary Mullis
- Randall Saiki
- Henry Erlich
Related topics
Seminal works
- saiki1985
- lodish2016
Frequently asked questions
- ¿Por qué la PCR necesita cebadores?
- Los cebadores definen los puntos de inicio de la síntesis en cada cadena, por lo que determinan qué región se copia y permiten que la polimerasa comience la extensión.
- ¿Qué hace que la amplificación sea exponencial?
- Las nuevas cadenas de cada ciclo se convierten en moldes en el siguiente ciclo, por lo que el número de copias del objetivo se duplica aproximadamente en cada ciclo.