单分子荧光和FRET

检测单个荧光分子的光，并利用两种染料之间的能量转移作为纳米尺，实时观察构象变化。

Definition

单分子荧光是每次检测一个荧光团的发射；FRET是供体和受体染料之间非辐射能量转移，其效率强烈依赖于它们之间的距离。

Scope

本主题涵盖单分子水平的荧光检测和作为距离测量的福斯特共振能量转移（FRET）：使单分子检测成为可能的光物理学，将FRET转化为几纳米范围内尺子的强距离依赖性，以及单对FRET揭示的构象动力学。基于力的单分子方法在相关主题中讨论。

Core questions

• 如何才能检测到单个荧光分子的光？
• 为什么FRET效率如此强烈地依赖于供体-受体距离？
• 单对FRET能揭示哪些整体FRET无法揭示的信息？
• 这些测量的空间和时间分辨率受哪些因素限制？

Key theories

FRET作为纳米尺

能量转移效率以供体-受体距离的六次方衰减，围绕一个特征性的福斯特距离，因此测量的效率可以高灵敏度地报告几纳米的距离变化。

动力学的单对观察

跟踪单个供体和受体之间的FRET可以揭示单个分子的实时构象转变，暴露出整体平均所掩盖的状态和动力学，这首先由Ha及其同事证明。

Mechanisms

单分子检测通过将激发和收集限制在微小体积内，并使用灵敏的探测器，使单个荧光团的光子在背景之上突出。当供体染料在具有重叠光谱的受体附近被激发时，能量以非辐射方式转移，其效率由福斯特半径周围的六次方距离依赖性决定；因此，测量相对的供体和受体发射可以报告它们之间的距离。在单个标记分子上跟踪此信号可以实时揭示其构象状态以及它们之间转变的速率。

Clinical relevance

这些方法揭示了作为生物医学靶点的受体、酶和核酸机器的构象机制，提供了对分子功能的教育性见解，而非临床指导。

History

福斯特于1948年提出的共振能量转移理论提供了距离依赖性；在首次光学检测到单分子后，1990年代的单对FRET测量将该原理转化为观察单个分子形状变化的工具。

Key figures

• Theodor Förster
• Taekjip Ha
• Shimon Weiss
• W. E. Moerner

Seminal works

• ha1996
• forster1948

Frequently asked questions

为什么FRET被称为分子尺？

因为两种染料之间能量转移的效率强烈依赖于它们之间的距离，以至于测量的信号可以直接转换为大约2到8纳米的距离。

与整体FRET相比，观察单个分子有何额外优势？

它显示了单个分子的构象状态和转变的实际序列，包括瞬态或稀有状态，而不仅仅是整体测量提供的群体平均值。