共聚焦和荧光显微镜

荧光显微镜通过激发荧光分子并收集它们发出的长波长光来对样本成像，从而获得高对比度、分子特异性的细胞图像。共聚焦显微镜增加了针孔，可阻挡离焦光，产生清晰的光学切片，可组装成细胞的三维视图。

Definition

荧光显微镜利用荧光团对光的吸收和再发射来对标记结构成像；共聚焦显微镜是一种荧光技术，其中针孔排除离焦光，因此只有薄的焦平面有助于每个图像的形成，从而产生光学切片。

Scope

本条目涵盖荧光对比的原理、共聚焦成像的光学切片优势，以及将荧光成像推至衍射极限以下的各类超分辨方法。它将这些视为细胞生物学中的成像方法，而非临床指导。

Core questions

• 荧光如何在细胞中提供分子对比度？
• 共聚焦针孔如何产生光学切片？
• 细胞的三维图像是如何重建的？
• 超分辨方法如何超越衍射极限？

Key concepts

• 荧光激发和发射
• 荧光团和荧光蛋白
• 共聚焦针孔和光学切片
• 三维重建
• 光漂白和光毒性
• 超分辨（无衍射限制）成像

Mechanisms

在荧光显微镜中，荧光团吸收激发光并以更长的波长再发射，通过滤光片将其与激发光分离，从而在黑暗背景下获得明亮、特异的对比度，如Lichtman和Conchello所综述。然而，传统的荧光图像包含来自焦平面上方和下方的模糊光；共聚焦显微镜将针孔置于与焦点共轭的位置，从而阻挡离焦光，产生Conchello和Lichtman所描述的光学切片，这些切片可以堆叠成三维图像。由于发射（与所有光学显微镜一样）仍然受到衍射极限的限制，因此超分辨方法，例如由Hell和Wichmann引入的受激发射损耗显微镜，通过操纵荧光过程本身来解析远低于该极限的细节，如Schermelleh及其同事所调查。

Clinical relevance

共聚焦和荧光显微镜广泛应用于病理学、眼科学和生物医学研究，用于分子定位和三维组织成像。本条目解释了所涉及的成像原理，属于参考教育性质，并非个体诊断或治疗决策的依据。

History

共聚焦原理由Marvin Minsky在20世纪50年代构想，但实用的激光扫描共聚焦显微镜以及明亮的合成和基因编码荧光团使荧光成像在20世纪末在细胞生物学中占据主导地位。随后，受激发射损耗显微镜（Hell & Wichmann, 1994）及相关技术突破了衍射极限，开启了由Schermelleh及其同事总结的超分辨荧光成像时代。

Key figures

• Jeff Lichtman
• Jose-Angel Conchello
• Stefan Hell
• Marvin Minsky

Seminal works

• lichtman-2005
• conchello-2005
• hell-1994
• schermelleh-2010

Frequently asked questions

共聚焦针孔有什么作用？

它的位置使得焦平面以外的光被阻挡，只留下焦内光形成图像；这会产生一个薄的光学切片，可以与其他切片组合成三维视图。

荧光显微镜如何突破衍射极限？

受激发射损耗显微镜等超分辨方法控制荧光发射过程，从而可以解析远低于经典衍射极限的细节。