Phát hiện gen và đột biến kháng thuốc bằng phương pháp phân tử

Phát hiện kháng thuốc bằng phương pháp phân tử xác định trực tiếp các yếu tố di truyền quyết định tình trạng kháng kháng sinh, thay vì suy luận kháng thuốc từ sự phát triển của vi khuẩn khi có mặt thuốc. Phương pháp này bao gồm khuếch đại axit nucleic có mục tiêu của các gen kháng thuốc đã biết, phát hiện các đột biến điểm liên quan đến kháng thuốc và giải trình tự toàn bộ bộ gen để khảo sát toàn bộ hệ gen kháng thuốc (resistome).

Definition

Phát hiện kháng thuốc bằng phương pháp phân tử là việc sử dụng khuếch đại axit nucleic, lai ghép hoặc giải trình tự để xác định các gen kháng thuốc, các yếu tố di truyền di động của chúng hoặc các đột biến liên quan đến kháng thuốc trong một vi sinh vật, đặc trưng hóa trực tiếp cơ sở di truyền của kháng thuốc.

Scope

Mục này bao gồm các xét nghiệm phân tử có mục tiêu đối với các gen kháng thuốc mắc phải và các đột biến kháng thuốc trên nhiễm sắc thể, các nền tảng tích hợp nhanh được sử dụng tại hoặc gần điểm chăm sóc, và đặc tính hóa dựa trên giải trình tự với các cơ sở dữ liệu gen kháng thuốc được tuyển chọn. Mục này cũng đề cập đến mối liên hệ giữa kiểu gen và kiểu hình. Đây là tài liệu tham khảo về phương pháp luận và không đưa ra hướng dẫn điều trị.

Core questions

• Sinh vật này mang những gen hoặc đột biến kháng thuốc nào?
• Các xét nghiệm có mục tiêu, nền tảng tích hợp nhanh và giải trình tự toàn bộ bộ gen khác nhau về phạm vi và cách sử dụng như thế nào?
• Kiểu gen được phát hiện dự đoán kiểu hình kháng thuốc tốt đến mức nào?

Key concepts

• Các gen kháng thuốc mắc phải và hệ gen kháng thuốc (resistome)
• Các đột biến điểm liên quan đến kháng thuốc (ví dụ: rpoB đối với rifampicin)
• Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và khuếch đại axit nucleic
• Các nền tảng nhanh tích hợp dựa trên hộp mực
• Giải trình tự toàn bộ bộ gen và cơ sở dữ liệu gen kháng thuốc
• Các yếu tố di truyền di động (plasmid, transposon, integron)
• Dự đoán và sự không phù hợp giữa kiểu gen-kiểu hình

Mechanisms

Các xét nghiệm phân tử có mục tiêu khuếch đại và phát hiện các gen hoặc đột biến kháng thuốc cụ thể: khuếch đại axit nucleic có thể xác định các gen mắc phải như các yếu tố quyết định carbapenemase hoặc kháng methicillin, hoặc các đột biến trên nhiễm sắc thể như thay đổi rpoB gây kháng rifampicin ở Mycobacterium tuberculosis (boehme-2010). Các nền tảng tích hợp dựa trên hộp mực kết hợp chiết tách, khuếch đại và phát hiện để đưa ra kết quả kiểu gen nhanh chóng từ các mẫu lâm sàng. Giải trình tự toàn bộ bộ gen khảo sát toàn bộ các yếu tố quyết định kháng thuốc, được đối chiếu với các cơ sở dữ liệu gen kháng thuốc mắc phải được tuyển chọn để dự đoán kháng thuốc (zankari-2012; ellington-2017). Bởi vì nhiều gen kháng thuốc nằm trên các yếu tố di truyền di động như plasmid, transposon và integron, các phương pháp phân tử cũng giúp đặc trưng hóa bối cảnh di truyền và tiềm năng lây lan của chúng (partridge-2018; strahilevitz-2009). Phát hiện kiểu gen nhanh chóng nhưng không phải lúc nào cũng dự đoán được kiểu hình, vì sự hiện diện của gen, biểu hiện và các cơ chế bổ sung đều đóng góp (ellington-2017).

Clinical relevance

Phát hiện phân tử hỗ trợ nhận dạng nhanh chóng các yếu tố quyết định kháng thuốc để giám sát, kiểm soát nhiễm khuẩn và quản lý kháng sinh, đồng thời có thể đặc trưng hóa các đợt bùng phát và lây truyền. Mục này mô tả các phương pháp này như kiến thức tham khảo về cách phát hiện và đặc trưng hóa kháng thuốc; nó không cung cấp các khuyến nghị chẩn đoán hoặc kê đơn cá nhân.

Epidemiology

Giám sát dựa trên giải trình tự các gen kháng thuốc và các yếu tố di động của chúng đã trở thành trung tâm trong việc theo dõi sự xuất hiện và lây lan kháng thuốc trên toàn cầu, liên kết các chủng phân lập giữa các môi trường và tiết lộ sự phổ biến của các yếu tố quyết định mang plasmid (partridge-2018; strahilevitz-2009; ellington-2017).

History

Phát hiện kháng thuốc bằng phương pháp phân tử đã phát triển từ các xét nghiệm dựa trên PCR cho từng gen vào những năm 1990 và 2000 thành các nền tảng tích hợp nhanh và, ngày càng nhiều, giải trình tự toàn bộ bộ gen. Một cột mốc quan trọng trong việc áp dụng lâm sàng là xét nghiệm hộp mực tự động để phát hiện đồng thời Mycobacterium tuberculosis và kháng rifampicin, đã đưa việc phát hiện kháng thuốc kiểu gen nhanh chóng vào thực hành thường quy (boehme-2010), trong khi các cơ sở dữ liệu được tuyển chọn cho phép xác định có hệ thống các gen kháng thuốc mắc phải từ dữ liệu trình tự (zankari-2012).

Debates

Giải trình tự có thể thay thế xét nghiệm độ nhạy cảm kiểu hình không?

Giải trình tự toàn bộ bộ gen có thể dự đoán kháng thuốc cho một số kết hợp sinh vật-thuốc nhưng không đáng tin cậy cho tất cả, vì sự hiện diện của gen không đảm bảo biểu hiện và không phải mọi cơ chế đều được ghi lại trong các cơ sở dữ liệu hiện tại; mức độ kiểu gen có thể thay thế kiểu hình vẫn chưa được giải quyết.

Giải thích sự không phù hợp giữa kiểu gen-kiểu hình

Các gen kháng thuốc được phát hiện đôi khi không biểu hiện kiểu hình, và các kiểu hình kháng thuốc đôi khi thiếu một giải thích di truyền đã biết, vì vậy việc đối chiếu kết quả phân tử và kiểu hình vẫn là một thách thức về phương pháp luận.

Seminal works

• boehme-2010
• zankari-2012
• ellington-2017

Frequently asked questions

Sự khác biệt giữa phát hiện gen kháng thuốc và đo lường kháng thuốc là gì?

Các phương pháp phân tử phát hiện trực tiếp yếu tố di truyền quyết định kháng thuốc, trong khi xét nghiệm độ nhạy cảm đo lường xem sinh vật có thực sự phát triển khi có mặt thuốc hay không; một gen có thể hiện diện mà không được biểu hiện, vì vậy hai kết quả có thể không khớp nhau.

Giải trình tự toàn bộ bộ gen có thể bổ sung gì cho việc phát hiện kháng thuốc?

Giải trình tự có thể khảo sát toàn bộ các gen và đột biến kháng thuốc cùng một lúc và đặc trưng hóa bối cảnh di truyền di động của chúng, hỗ trợ giám sát và điều tra dịch bệnh, mặc dù dự đoán kiểu hình của nó chưa đáng tin cậy cho mọi kết hợp sinh vật-thuốc.

Tại sao các yếu tố di truyền di động lại quan trọng trong phát hiện phân tử?

Nhiều gen kháng thuốc được mang trên plasmid, transposon và integron có thể di chuyển giữa các vi khuẩn, vì vậy việc phát hiện và đặc trưng hóa các yếu tố này giúp giải thích cách kháng thuốc lây lan.