Hóa mô miễn dịch và các phương pháp phát hiện protein

Hóa mô miễn dịch (IHC) định vị và đo lường protein trong các lát cắt mô bằng cách sử dụng kháng thể gắn với một nhãn có thể nhìn thấy, cho biết sản phẩm gen được biểu hiện ở đâu và, bán định lượng, với số lượng bao nhiêu. Là phương pháp tương đương ở cấp độ protein với định lượng bản phiên mã, đây là một công cụ thường quy trong chẩn đoán và bệnh học phân tử.

Definition

Hóa mô miễn dịch là một phương pháp dựa trên mô sử dụng các kháng thể được đánh dấu để phát hiện các protein cụ thể tại chỗ (in situ), hình dung vị trí tế bào và dưới tế bào của chúng, và cung cấp ước tính bán định lượng về biểu hiện protein.

Scope

Chủ đề này bao gồm nguyên tắc phát hiện dựa trên kháng thể, sự khác biệt giữa định vị định tính và chấm điểm bán định lượng về cường độ và mức độ nhuộm, tầm quan trọng của việc tiêu chuẩn hóa và kiểm soát, và các ứng dụng nổi tiếng như đánh giá thụ thể hormone và HER2 như những minh họa về phương pháp. Nó coi IHC là một phương pháp đo lường và không cung cấp ngưỡng chẩn đoán hoặc hướng dẫn điều trị.

Core questions

• Làm thế nào các kháng thể được đánh dấu định vị một protein trong một lát cắt mô?
• Làm thế nào việc nhuộm được chuyển đổi thành một điểm số bán định lượng?
• Tại sao các kiểm soát và tiêu chuẩn hóa lại cần thiết cho IHC có thể tái lập?
• Làm thế nào việc phát hiện ở cấp độ protein bổ sung cho định lượng bản phiên mã?

Key concepts

• Liên kết kháng thể-kháng nguyên
• Phục hồi kháng nguyên
• Phát hiện sắc tố và huỳnh quang
• Chấm điểm bán định lượng (cường độ và mức độ)
• Kiểm soát dương tính và âm tính
• Ảnh hưởng của việc cố định trước phân tích

Mechanisms

Một kháng thể sơ cấp liên kết với kháng nguyên mục tiêu của nó trong một lát cắt mô cố định; sự phát hiện được khuếch đại thông qua các kháng thể thứ cấp và các hệ thống liên kết enzyme hoặc huỳnh quang tạo ra một kết tủa có màu hoặc huỳnh quang tại vị trí của kháng nguyên. Các bước cố định và phục hồi kháng nguyên ảnh hưởng đến việc các epitope có còn có thể phát hiện được hay không, vì vậy việc xử lý trước phân tích ảnh hưởng mạnh mẽ đến kết quả. Biểu hiện được đọc bán định lượng bằng cách đánh giá cường độ nhuộm và tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính, thường được kết hợp thành một điểm số; vì việc đọc này phụ thuộc vào người quan sát và quy trình, cần có các kiểm soát đã được xác nhận và các quy trình tiêu chuẩn hóa để đảm bảo khả năng tái lập. Các hướng dẫn chuyên môn minh họa cách chấm điểm và các biến tiền phân tích được tiêu chuẩn hóa cho việc xét nghiệm thụ thể (Hammond et al., 2010; Wolff et al., 2013).

Clinical relevance

IHC là trung tâm của chẩn đoán mô và báo cáo các dấu ấn sinh học protein, và việc hiểu bản chất bán định lượng của nó là một phần của việc diễn giải các báo cáo bệnh học. Mục này mô tả phương pháp và việc tiêu chuẩn hóa của nó; các hướng dẫn được trích dẫn được tham chiếu để minh họa phương pháp luận và báo cáo, không phải để cung cấp các điểm cắt chẩn đoán hoặc quyết định điều trị cho từng bệnh nhân.

Evidence & guidelines

Việc tiêu chuẩn hóa IHC bán định lượng được minh họa bằng các hướng dẫn chung của ASCO/CAP về xét nghiệm thụ thể estrogen và progesterone (Hammond et al., 2010) và về xét nghiệm HER2 trong ung thư vú (Wolff et al., 2013), trong đó xác định các yêu cầu về xử lý trước phân tích, chấm điểm và kiểm soát. Chúng được trích dẫn ở đây như các tài liệu tham khảo về phương pháp luận.

History

Nhuộm mô dựa trên kháng thể phát triển từ miễn dịch huỳnh quang vào giữa thế kỷ XX, tiếp theo là các phương pháp miễn dịch peroxidase liên kết enzyme cho phép nhuộm vĩnh viễn, có thể nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học. Khi các dấu ấn sinh học protein trở thành trung tâm của bệnh học, sự chú ý chuyển sang tiêu chuẩn hóa việc cố định, phục hồi kháng nguyên và chấm điểm, được chính thức hóa trong các hướng dẫn đồng thuận cho xét nghiệm thụ thể (Hammond et al., 2010; Wolff et al., 2013).

Debates

Khả năng tái lập của việc chấm điểm IHC bán định lượng như thế nào?

Vì cường độ và mức độ nhuộm được đánh giá bằng mắt thường và phụ thuộc vào việc cố định và quy trình, kết quả có thể thay đổi giữa các người quan sát và phòng thí nghiệm; các quy trình tiền phân tích tiêu chuẩn hóa, các kiểm soát đã được xác nhận và các tiêu chí chấm điểm được xác định được sử dụng để cải thiện khả năng tái lập.

Key figures

• M. Elizabeth Hammond
• Antonio Wolff
• D. Craig Allred

Seminal works

• hammond-2010
• wolff-2013

Frequently asked questions

Hóa mô miễn dịch có định lượng được không?

IHC được mô tả tốt nhất là bán định lượng: nó ước tính biểu hiện protein bằng cách đánh giá cường độ nhuộm và tỷ lệ phần trăm tế bào dương tính thay vì tạo ra một nồng độ chính xác, đó là lý do tại sao việc chấm điểm và kiểm soát tiêu chuẩn hóa lại quan trọng.

Tại sao việc cố định mô lại ảnh hưởng đến kết quả IHC?

Việc cố định và bước phục hồi kháng nguyên sau đó có thể che giấu hoặc làm lộ các epitope mà kháng thể liên kết, vì vậy sự thay đổi trong xử lý trước phân tích có thể làm thay đổi việc nhuộm và phải được tiêu chuẩn hóa để có kết quả đáng tin cậy.